Conservation des anticorps précédent immunofluorescence

[invite84b0382c]

Bonjour à tous,

J'utilise des anticorps pour reconnaitre certains compartiments endosomal de macrophages. J'effectue un double marquage en utilisant ces anticorps dans un premier temps puis des anticorps fluorescent par la suite.
Je prépare mes anticorps à des dilutions de l'ordre de 1/500 à 1/2000 en PBS 5% SVF.

Selon mon boss, je ne peux pas les garder après utilisation: après chaque manip, je dois donc les jeter et en refaire si j'ai un autre marquage à faire.

La question est la suivante: pourquoi ?

Merci par avance
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[invitea0443c8c]

Salut!
Cela dépend des anticorps... Perso il m'arrive de garder des sauces une nuit ou deux à -20. Certains Ac se récupèrent après utilisation.
Je suppose que c'est la stabilité de l'Ac, après première décongélation, qui diminue...

A+
Vinc

[Jean-Luc P]

Oui, les anticorps supportent très mal les cycle congélation-décongélation : on a pour coutume de les "aliquoter" pour ne les décongeler qu'une fois et de garder une faible quantité à 4°C, car la qualité de l'anticorps va bien finir par chuter (mais on peut souvent les garder 1-2 mois à 4°C).

[invitea0443c8c]

Je prépare mes anticorps à des dilutions de l'ordre de 1/500 à 1/2000 en PBS 5% SVF.

Rassure moi : ce sont les dilutions de tes anticorps PRIMAIRES!!! Pas secondaire j'espère sinon tu dois exploser le bruit de fond...

Vinc

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite84b0382c]

Rassure moi : ce sont les dilutions de tes anticorps PRIMAIRES!!! Pas secondaire j'espère sinon tu dois exploser le bruit de fond...

Vinc

PRIMAIRE et SECONDAIRE, et pas de bruit de fond. Mes primaires vont de 1/500 pour un anticorps donné mais le max que j'utilise c'est 1/2000. Il s'agit surement d'anticorps très spécifique car j'ai mes structures très bien marquées. Pour le secondaire, j'utilise toujours 1/500 en dilutions quelque soit le primaire =)

Je fais une saturation en PBS 10% SVF 20 minutes avant de faire mon Ab primaire. J'avais deja fait comme ca dans mon précédent labo.

Sinon autre question, avec un anticorps donné, j'ai de meilleur résultat visuel avec une perméabilisation saponine 0.1% alors qu'avec les autres une simple perméabilisation Triton suffit. C'est juste par curiosité mais si quelqu'un sait pourquoi ?