Bonsoir
Est ce que en immunofluorescence, pour réaliser un co-marquage, les anti corps primaires doivent provenir d'espèce différente ???
pour moi ce n'est pas obligatoire dès le moment ou on a des anticorps et des anti anti corps marqués. Le problème c'est ya t'il des anti anti corps de meme espece? Il faut ptetre que les anti anti corps soient d'une espece différente?
Merci d'avance!
Dernière modification par piwi ; 05/09/2008 à 13h17.
Il n'existe pas d'anticorps anti anti corps chez une même espèce. Cela conduirait à une maladie autoimmune. Les anticorps secondaires se fixent sur les sites invariables des anticorps, un tel anticorps s'attaquerait donc à lui même et aux autres types d'anticorps de l'organisme!
Pour éviter ce genre de problème les lymphocytes B sont "éduqués", c'est à dire que ceux qui posent des problèmes de ce genre sont éliminés.
c'est tres fortement recommande d'utiliser des anticorps (Ac) d'especes differentes pour eviter les cross reactions.Envoyé par Douviss
si tes 2 Ac primaires sont de meme especes, comment les Ac secondaires meme marques vont t ils faire la difference entre ta prot A et ta prot B a localiser?
donc pour resumer et donner un exemple general, si tu cherches a montrer la localisation d'un prot A et d'un prot B dans une cellule/tissu...
tu vas utiliser en Ac primaires par exemple un Ac anti-A de souris et Ac anti-B de lapin.
pour ce qui est des secondaires, tu peux par exemple utiliser un Ac de chevre anti souris (pour al prot A)
et un Ac de souris anti lapin (pour la prot B)
si t'attque des le debut pour reconnaitre des prot A et B avec 2 Ac differents provenant de la meme espece, lors de l'incubation des Ac secondaires, ces Ac n'auront aucun moyen de differentier qui est qui et donc tu auras une belle co-localisation 100%
en esperant avoir ete clair.
toll
Salut,
le seul cas où tu peux utiliser 2 anticorps primaires de la meme espece, c'est quand l'un des 2 est directement couplé (fluorochrome ou biotine). Dans ce cas ca marche, à condition de respecter un ordre précis: primaire non marqué, secondaire, saturation, primaire couplé.
la je sais vraiment plus parceque j'ai l'impression que Toll et biocell se contredisent ???
1 anti corps ne peut se fixer que sur 1 prot un autre anti coprs de la meme spece peut se fixer sur une autre prot. ca c'est possible ??? pour moi oui et c'est meme evident.
Ensuite maintenant vu les reponses que j'ai eu j'ai un doute sur le co-marquage est ce que il s'agit de localiser 2 proteines cellules .... avec 2 anti corps diff ou il s'agit d'un marquage indirect??? 1 anti anti corps qui se fixe sur un anti coprs primaire qui lui est fixé a la cible ?
si c'est le 1er cas on utilise 2 anti coprs d ela meme espece marqué préalablement
si c'est le 2 nd cas les queue des anti coprs sont identique dans la meme espece ce qui ne permet pas de faire une co localisation et dans ce cas on doit utiliser 2 espece différentes.
Pour faire ceci régulièrement :
Oui tu peux utiliser des anticorps primaires isus de la meme espèce à condition de ne pas utiliser des anticorps d'isotypes identiques : exemple
anticorps de souris d'isotype IgG1 anti A
avec anticorps de souris d'isotype IgG2a anti B
pour la première couche, tu identifie les protéines A et B
puis pour réveler :
anticops de chèvre anti souris IgG1-fluo (rouge)
anticorps de chèvre anti souris IgG2a-fluo (vert)
si tes protéines A et B colocalisent tu auras superposition des deux fluorescences
il ne faut pas oublier de réaliser un contrôle négatif avec des anticorps "isotypes control" IgG1 et IgG2a de souris en première couche!
Rq : on est souvent conduit à faire ceci car beaucoup d'anticorps primaires sont faits chez la souris ! sinon effectivement utiliser des sources provenant d'espèces différentes est encore mieux
j'espere t'avoir aidé! sinon n'hésite pas demander des précisions
Re : marquage immunofluorescence et microscope
Bonjour,
Voilà j'ai une question peut-être un peu bête, mais qui me turlupine.
Au cours d'un stage en laboratoire, je me suis familiarisée avec la technique de l'immunofluorescence. Une fois les marquages effectués sur mes cellules, je les ai observées au microscope à immertion (Leica). Pour pouvoir les observer, on m'a dit d'ensemencer mes cellules sur les lamelles de verre. Pourquoi du verre et non du plastique ? Parce que le plastique absorbe plus certaines longueurs d'ondes que le verre ? Parce que le plastique diffracte d'avantage la lumière que le verre ?Je ne sais pas. Pouriez vous m'éclairer ?
Merci
PS : Je ne sais pas si mon message est bien placé.
Re : Marquage immunofluorescence
bonjour !
je suis étudiante en thèse et je suis moi aussi en train de m'initier à la cytométrie de flux et je trouve bcp de difficultés à justifier au prés de mon directeur de thèse l'importance d'utiliser (et donc d'acheter ) des anti corps de contrôle pour chaque marquage surtout qu'il à bien vu une énorme différence ds l'intensité de marquage quant je passe le même tube sans avoir passé le tube contrôle et aprés l'avoir passé.
merci de m'éclaircir sur le sujet !!
