Problème de detection de ma protéine par immunofluorescence

[invite9a7a6874]

Bonjour,

J'ai un problème (encore... décidémént ce stage n'est que problèmes ^^)

voila j'ai transfecté mes cellules (HepaRG) avec un plasmide pcDNA3.1 Directional TOPO (Invitrogen) contenant mon insert d'intérêt (la protéase NS3 du virus de l'hépatite C). Ce plasmide contient aussi une tag V5, qui me permet (normalement ^^) de detecter ma protéine une fois exprimée dans mes cellules (grace à un anticorps anti-V5, Invitrogen). Je suis obligée de passer par ce tag pour détecter ma protéase car il n'existe pas d'anticorps monoclonal spécifique de la protéase NS3...

j'ai fixé mes cellules avec du méthanol pur froid (-20°C) 48 heures apres la transfection 10 min, à 4°C. J'ai lavé avec du PBS, incubé avec mon anticorps anti-V5 (dilué au 1/200ème) 1h à 37°C, relavé avec du PBS et incubé 1h à 37°C avec mon anticorps anti IgG de souris couplé au FITC.
Relavage et observation au microscope. Mais là je n'ai rien vu du tout...je n'ai pas detectée ma protéine...

Je sais que ma transfection a fonctionnée car j'ai effectué en controle une trasfection HepaRG/plasmide GFP (clontech) et j'obtiens mes résultats habituels...
Avant de continuer inutilement mes manips avec mon vecteur je souhaiterai vérifier que mon protocole de marquage est correct mais je ne dispose d'aucun plasmide vide avec le tag V5...==> pas moyen de faire des controles...
auriez-vous des idées de ce que je pourrai améliorer?ou faire?

merci d'avance

nanie53
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[Zellus]

Salut,

J'ai une question un peu bête mais as-tu vérifié que ta protéine de fusion NS3-V5 est bien exprimée dans tes cellules après transfection avec un simple SDS-PAGE ? Je n'ai jamais fait d'expression en cellules eucaryotes mais je suppose que c'est un peu comme pour les bactéries : tu dois pouvoir comparer dans ton gel entre des cellules induites et non induites non ?

Sinon, quelques autres idées :

• peut-être que tes anticorps sont trop vieux (trop congelés-décongelés)

• peut-être que V5 a une conformation qui n'est pas reconnue par ton anticorps lorsqu'il est en fusion NS3-V5

mais je ne dispose d'aucun plasmide vide avec le tag V5...==> pas moyen de faire des controles...

Et ton plasmide pcDNA3.1 Directional TOPO sans insert n'a pas déjà l'étiquette V5 ?

encore... décidémént ce stage n'est que problèmes ^^

Comme tous les stages... lol

Voilà, c'est pas grand chose mais bon ...