Détection d'une protéine

[invite9a7a6874]

Bonjour,

j'ai cloné une séquence d'ADN dans un vecteur d'expression directionnel (Kit Invitrogen pcDNA3.1).
j'ai ensuite séquencé mes produits d'amplification (amorces dessinées spécifiquement en 5' et 3' de mon insert) pour vérifier que mon insert était correct et surtout entier. Et là, problème ma protéine est tronquée de 4nulcéotides.... (sans doute dû à une mauvaise hybridation de mon amorces et donc mauvaise amplification.. pourquoi je ne sais pas car je suis en conditions très peu stringentes..)
=> mon cadre de lecture est donc décalé et je ne vais donc pas pouvoir obtenir mon Tag qui m'aurait permis de detecter ma protéine de fusion suite à ma transfection....

auriez-vous des solutions pour détecter cette dite protéine, malgré le décalage???

merci d'avance pour vos réponse.

nanie53

P.S : je ne sais pas si j'ai été très claire dans ce résumé, n'hésitez pas si vous voulez plus de précisions
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[invite8c0cc995]

Question triviale, mais je pense que vous n'avez pas d'anticorps spécifiques ?
Sans ca me parait assez délicat.
Avez vous fait séquencer plusieurs clones ? Meme décallage dans tous les clones ?
Sinon pas le choix, faut refaire le clonage. S' il y a encore des sites de restrictions uniques en 3', il est possible d'y cloner une séquence composée de 2 longs oligos hybridés codant pour une étiquette, mais ca ne me semble pas beaucoup plus simple que de recommencer malheureusement.

[invitec38e3ca5]

Moi je voulais savoir au juste ce qu'était un vecteur, mais c'est pas tellement pour aider

[piwi]

Franchement Alegs, sur ce coup là ta question pollue vraiment le poste.

Sinon pour ce qui est de la question initiale je ne vois pas trop d'autre choix que de recloner. Il te reste des bactéries en boite? Dans ce cas là il n'y a pas grand chose de plus à refaire que des preps pour retenter sa chance en priant pour pour que ta mésaventure ne soit qu'occasionnelle.
Sinon, faut refaire le clonage. C'est pas si long.

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite7825c20b]

salut

4 nucléotides tu peux aussi les rajouter par mutagenèse dirigée, c'est rapide et efficace. En une nuit t'as muté, y a plus qu'à séquencer. Nous on le fait en routine et ça marche très bien.

[invite9a7a6874]

merci pour vos réponses!!

alors non je n'ai pas d'anticorps spécifique, il n'en existe aucun pour le moment qui reconnait cette protéine.

pour le reclonage, oui on y a pense le problème c'est qu'on ne comprend pas pourquoi nos amorces ne ce sont pas hybridées correctement :s

et enfin pour la mutagenèse dirigée, effectivement je n'y avais pas pense!! y a-t-il un protocole plus rapide que d'autres??

merci encore!!

[invitec9f0f895]

salut

tu vas galérer pour rien!!! reclone ton insert ca sera le plus rapide crois moi!
Sinon ce ne sont pas tes oligos qui se sont mal appariés, mais la synthese de ceux-ci qui n'est jamais parfaite. Du coup tu te trimballes des oligos imparfaits et de temps en temps manque de bol ce sont eux qui amplifient! (mon record c'est 9 bases en moins sur un oligo purifiés pourtant!)

Teste d'autres clones tu verras ca marchera.
YOyo

[Zellus]

Salut tout le monde,

Ce que tu veux dire Yoyo, c'est que quand tu commandes des amorces (chez Sigma ou autre) tu peux avoir un mélange de bonnes et mauvaises séquences dans ton tube c'est bien ça ?
Pour ma part, je me demande si je n'ai pas que des mauvais oligos parce que j'ai refait 5 fois mon clonage (digestion plasmide, insert, PCR ...) et quand je séquence je retrouve tout le temps le même problème : il me manque au moins 20 nucléotides et y en a 4 qui sont apparus (TTGG je crois).
Du coup on a commandé d'autres amorces. Penses-tu (ou quelqu'un d'autre) que le problème venait des amorces ?

Merci d'avance pour votre réponse

Zellus