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purification d'une protéine



  1. #1
    ptiteaurelie

    purification d'une protéine

    Bonjour,

    Etudiante en biologie, je n'arrive pas à répondre à une question d'annale d'examen... Dans l'examen, il s'agit en fait d'une ligase, dont on vient d'obtenir la séquence.
    On nous demande quelle reaction son catalysée par la ligase => ok

    Puis, dans différentes expériences, on mesure son activité: en fonction du pH, de la température, de la concentration en ATP, ou de cations ou de sels et de sa resistance a la phosphatase.

    On nous dit par la suite que la séquence codante de cette ligase a été introduite dans E.coli, puis que la protéine est purifiée en deux étapes. Aux différentes étapes de purification, on fait un gel dénaturant d'un aliquote des échantillons.
    (On nous donne la photo d'un gel dénaturant donc avec 4 piste: 1: le marquer de PM, 2: extrait protéique brut, 3rot. après la premiere étape de purification et 4: protéine après la deuxième étape de purification)

    Là est le problème ...Je ne comprend pas par quelle téchnique on peut purifier cette protéine dont on connait uniquement la séquence... peut-on purifier la protéine grâce aux résultats obtenues dans les différentes expériences?

    Je vous remercie d'avance

    -----


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  3. #2
    Pseudomonas

    Re : purification d'une protéine

    Bonjour Aurélie,

    Je ne suis pas du tout experte en purification de protéines mais en lisant les différentes étapes de la manip je me dis qu'en insérant la séquence codante pour la ligase dans E. coli, ils ont peut être en même temps créé une protéine de fusion avec une étiquette (par exemple GST ou Tag) et ont pu ensuite purifier cette protéine de fusion sur une colonne d'affinité. Peut être que quelqu'un de qualifié t'en diras un peu plus.

    Cordialement,


  4. #3
    Vinc

    Re : purification d'une protéine

    Oui ca me paraît être la meilleure méthode en effet.
    Pour le tag, tout dépend : biotin, GST ou éventuellement Myc, 6His, HA, ....


    V.
    Primum non nocere.

  5. #4
    ptiteaurelie

    Re : purification d'une protéine

    Rebonjour,

    Tout d'abord je vous remercie pour vos réponses.

    Cependant, d'après ce que vous me dites, j'isole la protéine grâce à l'étiquette sur colonne d'affinité. Donc je n'aurai sur mon gel, que les pistes 1 2 et 3 soit une seule piste de purification. Or, sur le gel dans la piste 3 et 4 il y a deux résultats de purification. Il semble que l'on a fait une étape ou l'on obtient la protéine "un peu plus" purifié de l'extrait cellulaire (la comparaison des deux nous donne quelques bandes en moins ) et dans le puit 4 une protéine "purifié" de façon plus nette (il ne reste que la bande de la protéine)...

    Je vous remercie encore pour vos réponses si rapide

  6. #5
    ptiteaurelie

    Re : purification d'une protéine

    Rebonjour,

    Tout d'abord je vous remercie pour vos réponses.

    Cependant, d'après ce que vous me dites, j'isole la protéine grâce à l'étiquette sur colonne d'affinité. Donc je n'aurai sur mon gel, que les pistes 1 2 et 3 soit une seule piste de purification. Or, sur le gel dans la piste 3 et 4 il y a deux résultats de purification. Il semble que l'on a fait une étape ou l'on obtient la protéine "un peu plus" purifié de l'extrait cellulaire (la comparaison des deux nous donne quelques bandes en moins ) et dans le puit 4 une protéine "purifié" de façon plus nette (il ne reste que la bande de la protéine)...

    Je vous remercie encore pour vos réponses si rapide

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    doubleD

    Re : purification d'une protéine

    salut

    ça pourrait être du à l'utilisation d'une technique de TAP-tag. Tu fusionnes ton ORF à une étiquette tripartite: 2 motifs permettant la purification (6His et prot A par exemple) séparés par un site de coupure par une protéase (TEV en général).
    Tu fais une première purification et tu sors ta protéine plus des protéines aspécifiques. En coupant tu détaches de ta colonne uniquement ta protéine (ou presque), et tu repurifies après. Au final la deuxième purif donne une protéine plus pure que la première (moins de bandes parasites).

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  10. #7
    ptiteaurelie

    Re : purification d'une protéine

    Bonsoir,

    Merci doubleD pour m'avoir répondu. Je ne connaissais pas du tout cette technique. Youpi, une de plus à la liste...

    Merci à tous pour vos réponses!

  11. #8
    vince0319

    Re : purification d'une protéine

    bonjour,
    je purifie des proteines, produitent en systeme procaryote, à l'aide du systeme de bille magnétique en nickel de chez promega. mes proteines sont des prot taggé 6xhis. jaimerai savoir si il est possible de recycler ces bille pour une nouvelle utilisation. merci

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