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chromatographie échangeuse d'ions



  1. #1
    étudiantL2S3

    chromatographie échangeuse d'ions

    Salut,

    Je bloque sur le principe de purification de protéines.

    Je dépose 3 protéines sur une colonne échangeuse de cations à PH6(échangeuse de cation=colonne chargée positivement ???!!!). Les 3 protéines ont un PHi 4.5 ;6 et 7.5

    J'ai compris qu'il y a trois cas possibles en fonction du PHi : 1) PH<PHi 2) PH>PHi 3) PH=PHi. Pouvez vous me décrire ce qui se passe ?

    Merci beaucoup

    -----


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  3. #2
    † GØD™

    Re : chromatographie échangeuse d'ions

    Bonjour,

    Une colonne échangeuse de cations est chargée négativement, et va donc fixer des cations.

    Je pense que ce lien va t'aider : http://www.123bio.net/cours/chromato/cor8.html
    c'est la correction d'un exercice similaire au tien.

  4. #3
    étudiantL2S3

    Re : chromatographie échangeuse d'ions

    Merci de ta réponse,

    j'avais déjà vu cette page internet, j'ai compris ce qu'il se passe dans les cas où PH est inférieur ou supérieur au PHi, ca se fixe ou pas, la molécule est éluée ou pas.
    Mais dans le cas précis ou PH=PHi, la molécule est neutre, que se passe t-il ?

    Merci de votre aide

  5. #4
    wishangel

    Re : chromatographie échangeuse d'ions

    salut a toi,

    les billes sont chargées donc la proteine s'accroche aux billes si elle meme est chargée. Donc a t on avis que se passe t il si la charge global de la proteine est nul (cad sans charge)?

  6. #5
    étudiantL2S3

    Re : chromatographie échangeuse d'ions

    ben c'est possible qu'elle soit pas fixée puis éluée.. mais dans ce cas pourquoi distingue-t-on trois cas ?

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    ampicilline

    Smile Re : chromatographie échangeuse d'ions

    bonsoir,

    la chromatographie échangieuse de cation est une résine chargée nagativement donc elle fixe les molécules chargés positivement.

    le prtage selon la charge se fait en augmentant d'une façon graduelle le pH ,et quand le pH de la solution d'elution est égale au pHi de la molécule alors la charge globale est neutre,donc la protéine se détache de la résine .
    si je me trompe pas dans ton cas, on peut commencer à partir d'un pH < 4.5.
    on augmentant le pH, on récupére par ordre la protéine à pHi=4.5,pHi=6,pHi=7.5.
    bonne chance !!!!

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  10. #7
    Svenn

    Re : chromatographie échangeuse d'ions

    L'echangeuse de cations est une colonne permettant de trier les proteines en fonction de leur charge en liant les proteines chargees positivement. La charge d'une proteine est dependante du pH en raison de la presence de residus acides ou basiques. La proteine est chargee + a pH acide et - a pH basique. Et enfin, il existe un pH (dependant de le proteine) pour lequel tout s'equilibre et ou la charge est nulle.

    Donc une proteine aura tendance a s'accrocher a la colonne si le pH est inferieur a son pI et a se decrocher si il est superieur a son pI.

    Mais ca depend egalement de plein d'autres facteurs dont les deux plus importants sont :
    - La force ionique. Plus le tampon utilise contient de sel, plus les proteines se decrochent. A partir de 500 mM, quasiment aucune proteine ne tient sur une colonne quelque soit le pH.
    - La repartition des charges a la surface de la proteine. Si les charges + sont regroupees a la surface de la proteine, celle-ci va s'accrocher beaucoup plus efficacement que dans le cas contraire.

    Pour finir, en theorie tu vas decrocher les proteines dans l'ordre pI=4.5, pI=6 et pI=7.5. En pratique, ca peut etre assez souvent different.

  11. #8
    lipstyka

    Re : chromatographie échangeuse d'ions

    bonjour
    je pense que tu peux également regarder la composition de ton tampon d'élution. S'il contient des ions Na+, ce qui est souvent le cas, ces ions, de surcroit plus petits que tes protéines, vont entrer en compétition avec les protéines fixées, et ainsi faciliter leur élution. voila pourquoi il est très fréquent que les protéines soient éluées avant leur pHi.

  12. #9
    dott

    Re : chromatographie échangeuse d'ions

    Les protéines sont des "complexes" d'acide aminés qui comprennent des fonctions acides : COOH et amine RNH2. Les acides aminé ont la propriété de voir un proton H+ du groupement acide se fixer sur la fonction amine pour former un COO- et un ammonium RNH3+. Les protéines peuvent donc être doublement chargées + et -. Quand on augmente le pH on commence par fixer les protons sur les fonctions COO- et les acides aminés ont alors une charge exclusivement positive ce qui leur permet de se fixer sur des résines échangeuses de cations.
    Chaque fonction amine n'a pas la même basicité (pas le même pK). La neutralisation de chaque acide aminé (ou de chaque protéine) se fait successivement. Le pH de charge nulle est obtenuest obtenu quand l'acide aminé est sous sa forme normale (doublement chargée) à l'équilibre entre sa forme acide et sa forme basique. C'est, en gros, la moyenne des pK. Ainsi chaque acide aminé va prendre une charge nullle au dela du pK de sa fonction amine. Dans ce cas il sort de la résine. En augmentant graduellement le pH, on peut ains sortir successivement chaque protéine.

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