RT PCR one step de quiagen

[invite8ec06856]

salut a tous,
voila dans mon labo on fait de la RT PCR plus precisement une IC RT PCR sur du vegetal pour detecter un virus et on rencontre bcp de pb technique malgre de nombreuses precautions. du genre qu'on obtient des bandes positives pour ts nos echantillon y compris nos temoins sains et en plus de ces bandes on a le front de migration qui resort tres fortement en bas du gel (meme plus fort que les bandes positives). on pense que c d a des dimeres d'amorce qui ne se sont pas hybrider ou a un surplus de dNTP.
On utilise de l'eau ultra pure autoclave pour preparer nos tampons de l'eau RNase free fourni dans le kit, de la RNase inhibitor des cones a filtre, des cone autoclave; on travaille sous la hotte; on met les UV avant de travailler et on désinfecte les paillases avec du RNAse away.

pouvez vous m'eclairer sur ces pb que je rencontre?
Merci d'avance
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[inviteb8feed24]

salut
verifie que ton ARN ne contient pas aussi de l ADN avec qui il ya peut etre reaction ca mest deja arrive.
change a chaque fois un parametre: prends un nouveau tube de primers, etc...
bonne chance
vallee

[invite0bb219a4]

salut,

1- blast tes primers afin d etre sur qu'ils sont bien specifiques
2- Vérifie la qualité de tes ARN apres extractions
3- Travail en RNAse free, tubes, pointes, gants, eau....
4- utilise des primers controls (GAPDH....)

si tes resultats ne sont pas corrects apres tout ca...
5- change de pipettes ?
6- change de source d'ARN (extrait par une autre personne, groupe)....

[invite8ec06856]

salut,
je tiens a preciser qu' en fait on fait une IC RT PCR donc pas d'extraction d'ARN.
g fais une manip ou g change de kit et d'amorce, bref du materiel neuf et stérilisé et j'ai obtenu les memes résultats des bandes positives partout. puis une autre manip dans un autre labo mais avec notre materiel (j'ai fais autoclaver les pipettes cette fois ci) et ca a marché meme si quand meme on avait des bandes vraiment tres faible(a peine visible sur la photo) pour certains echantillons et pas pour les TS. puis une autre manip dans notre labo avec le meme materiel ( pipette passée au UV cette fois ci) et ca n'a pas marché.
il semblerait que l'on ai de l'ADN en suspension dans l'air, ce qui provoque nos contaminations. est ce possible

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

Bonjour,

Vous faites un temoins eau j'imagine. Y-a-t-il aussi une bande ?
Si oui, c'est que ce ne vient pas de vos echantillons. Ce qui est rassurant, vous n'avez pas à vous demander si vous devez les jeter.
Si elle disparait dans un autre labo alors que vous travaillez avec le même materiel c'est que c'est quelque chose de spécifique à votre labo comme vous le suggerez. J'ai pourtant du mal à croire que votre air soit tellement saturé en cochonneries qu'il contamine le résultat d'une PCR.

Revoyez exactement la séquence des evenement chez vous et dans l'autre labo. Il doit bien y avoir une source de contamination en ADN génomique (une fois que vous aurez éliminé l'hypothèse des oligo mal choisis)

Cordialement,
piwi

[invite8ec06856]

en effet, j'ai un temoin eau (sans AC; mix+eau); un temoin mix seulement et g des bandes dedans.
les amorces ont été trouvée par un chercheur qui certifie qu'elles sont tres spécifique.

[piwi]

Des bandes dans le mix sans oligos?