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calibration entre différents run en QPCR



  1. #1
    philadelphe

    calibration entre différents run en QPCR


    ------

    Bonjour,

    j'ai des résultats à analyser sur plusieurs runs et j'aimerais savoir comment comparer mes runs.
    je mets une gamme étalon (plasmide) ds chaque mais ensuite...
    il faut que j'aligne quoi? le threshold? l'efficacité? le slope?
    quel est le paramètre le plus important : le rsq ou l'efficacité?
    enfin voilà qq questions de base pour certain mais qui moi me pose qq pb
    si vous avez des réponses n'hésitez pas merci!

    -----

  2. #2
    sbrudy34

    Re : calibration entre différents run en QPCR

    Salut,
    Dans le cas de la quantification absolue.
    Si c'est le mm gene cible pour toutes tes PCR, en principe, tu n'as pas besoin de les aligner. Tu peux cependant faire varier la hauteur du threshold, histoire d'avoir des Ct équivalents pour tes points de gamme (c'est plus joli) dans toutes tes PCR.

    tu as certainement obtenu des efficacités équivalentes, donc à priori, tu peux utiliser tels quels les quantités obtenues. (PS, je vois pas comment aligner les PCR sur l'efficacité, et sinon, la slope (pente de la droite) est un paramètre qui te sert à calculer l'efficacité de ta PCR)

    Un élément qui facilite toutefois la vie pour recalibrer:
    il est nécessaire de faire des répliquats d'échantillons d'une plaque à l'autre histoire de pouvoir les comparer.
    L'idéal est d'avoir des échantillons (j'utilise pour ma part de l'ADN génomique bactérien) qui te servent de référence entre tes plaques.
    Tu pourras voir si la quantification de ces échantillons est toujours la même dans toutes tes PCR et te permettra d'appliquer un facteur correctif le cas échéant.

    j'espère avoir été clair.

  3. #3
    Nicolas.Ca

    Re : calibration entre différents run en QPCR

    Pour completer le post de sburdy34, tu peux effectuer aussi une quantification relative si tu es dans le cas d'un système complexe.

    Dans mon labo on fait une quantification relative à un "house keeping gene". Pour cela, tu dois choisir arbitrairement un gène dont la variation d' expression est la plus faible possible (on travaille sur des échantillons d'oreille de souris et on a choisit bêta-actine). La façon la plus rigoureuse de trouver ce gène c'est de testé différent primers sur une grande quantité de tes échantillons.

    Grâce à cette quantification relative, tu te retrouves avec une variation minime de l' expression en fonction de la quantité d' ADN introduite et tu peux gérer des résultats de différentes expériences plus sereinement.

    Attention toute fois! Dans cette situation tu dois tout de même faire attention à avoir extrait ton ADN de façon comparable. En effet, certains produits chimiques contenu dans différents kits d' extraction d'ADN peuvent perturber la lecture de fluorescence de l' échantillon.

    Je te conseille donc de vérifier la source de tes échantillons si tu n'as pas effectué toi même l'extraction, afin d' être sur de la composition de ceux-ci.
    Dernière modification par Nicolas.Ca ; 13/06/2010 à 22h18.

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