ELISA courbe d'etalonnage

[invitef05da679]

Bonjour,

J'ai un petit souci concernant le test d'ELISA et plus précisément sur l'analyse des résultats.
Du coupe je ne suis meme plus sure de ce que je pensais savoir
Pour moi yavait la methode indirect (ou direct) qui permet de determiner la presence et le dosage d'un anticorps dans un serum. Et la methode sandwich qui permet de determiner la presence et le dosage d'un antigene dans un serum. Deja suis je dans le vrai? :s
Ensuite du coup pour la methode sandwich je comprends qu'il faille faire une courbe d'etalonnage avec quantité d'ag connu, puis DO en fonction de la quantité d'antigène cqui permet de determiner la quantité d'antigene dans un echantillon a analyser. Mais pr l'ELISA indirect jcomprends pas. Je fais donc une coure d'etalonnage, DO en fonction d'ag, et?... :s Comment je fais pour trouver la quantité d'antcorps àa partir de cette courbe??? :s
Je sais pas si j'ai été clair, peut etre un peu trop longue :s
Merci d'avance a celui, cele ou ceux qui sauront m'eclairer
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[Tiscarab]

ok pour l'elisa sandwich mais pour l'indirect, il sert surtout à révéler des anticorps (ex dans le sérum) pour les doser c'est plus complexe car il te faut obligatoirement des solutions d'anticorps standard qui te permettront de calibrer le test et tu traceras la courbe A (on ne dit plus DO) =f(Ac) standard par exemple

[invitef05da679]

oki merci beaucoup

[inviteb8951d5a]

Huhu ben du coup j'en profite pour poser une question.

J'ai fait un test ELISA en TP, et on ne nous a rien expliqué sur l'interprétation des résultats. Je sais déjà que je ne peux pas tracer de courbe d'étalonnage, car nous n'avons pas réalisé de gamme standard.

Jveux juste savoir comment déterminer quels puits sont positifs et quels puits ne le sont pas. En comparant juste avec les blancs ?

J'ai cherché partout sur internet, et rien de bien clair

[A voir en vidéo sur Futura]

[Jean-Luc P]

Tout dépend si tu veux faire un test de détection ou un dosage.

DAns le cas d'un dosage il te faut faire une gamme, tu pourras doser mais avec une certaine marge d'erreur dépendant de ta valeur car la courbe d'étalonnage n'est asp une droite, si on a une quantité proche de la quantité poiyr laquelle la courde d'étalonnage a une forte pente ce sera très précis, dans le cas inverse la précision sera très faible.

Quant à la détection, si les témoins négatifs sont fats correctement, on peut se contenter d'une simple significativité statistiques : on fait souvent témoins et échantillons en trois exemplaires : si l'échantillon est significativement au-dessus du contrôle négatif le etst est déclaré positif.

[invite730fafc0]

Bonjour,
j'ai moi aussi qulque problèmes por analyser mes résultats d'un test elisa.
Nous avons fait une courbe étalon avec des IgG std, de concentration connue. Une fois cette courbe obtenue, nous cherchons la quantité d'IgG présents dans un la solution mère (hybridôme). Nous avons plusieurs dilutions de cet hybridöme. Par rapport à la courbe étalon, avec la DO de l'hybridome, rapportée à celle de l'IgG std, je dois trouver la concentration de l'hybridome.
QUand lhybridome est dilué, pour obtenir la concentration de la solution mère il me faut multiplier mon résultat par le facteur de dilution (a mois que je me trompe). Le problème est que je trouve des concentrations de plus en plus importantes, plus l'échantillon est dilué !

Je suis un peu perdue.. merci d'avance pour votre aide !

[invite802886a4]

bonsoir,
moi aussi je rencontre beaucoups de problèmes la dessus,on a fait récemment un TP sur caractérisation biochimique et immunologique des protéines,alrs on a commencé par un dosage des protéines par la methode de BRADFORD ou on doit utiliser un témoin,4 tubes essay et deux autre de dilution de l'immun serum 1/10 et 1/100 respéctivement,on a procédé par la suite à une lecture sur spectophotometre à 595nm(pourquoi plus exactement 595nm en sachant que le bradford est a 428 si je me trompe pas?) on a obtenus ls absorbances des c tubes avec lesquels on doit tracer une droite qui ne passera pas par le zero (pourquoi?),avec tous ces petits soucis je ne sais méme pas comment interpreter mes resultats.
cepandant,le bradford nous permet d'identifier et de doser ttoutes les protéines existant dans l'imunserum du cheval mais nous ,nous cherchons seulement les Ac produits (car on injecté de la toxine avnt),pour cela on utiliser la methode immunologique (celle d'ELISA)
on obtiendra une courbe d'etalonnage decroissante normalement,mon probleme est que j'ai obtenu le contraire,aprés avoir obtenu la courbe on doit chercher le titre du graphe qui correponds au dernier a donner une couleur c'est à dire la valeur qui précède celle correpondante au debut du plateau.
pour une petite précision : plus le titre est élevécela veut dire que le serum est riche en Ac.voila j'esper avoir eclaircit quelques notes,je souhaiterai avoir des réponses à mes questions,merci d'avnce.a bientot.

[invitede8315b3]

bonjour ,
cher micha ,fais ton 2eme graphe a l'ancienne sur le papier ,avec les resultats que la prof a donner, Do=f(1/dilution) et tu l'obtiendra ,quand au 595nm ,c la longeure d'onde a la quelle absorbe le reactif de bradford une foi lier a la proteine (il devient bleu) car c quand il est libre quil absorbe a 428 (il est normalement rouge) ,voila ,bonne chance

[invitedd60a00b]

Bonjour,

DAns le cas d'un dosage il te faut faire une gamme, tu pourras doser mais avec une certaine marge d'erreur dépendant de ta valeur car la courbe d'étalonnage n'est asp une droite, si on a une quantité proche de la quantité poiyr laquelle la courde d'étalonnage a une forte pente ce sera très précis, dans le cas inverse la précision sera très faible.

la courbe d'étalonnage est construite à partir de valeurs d'absorbance, c'est la loi de Beer Lambert A=épsilon*l*C, il ya donc une relation linéaire entre A et C, la courbe est donc une droite, mais on a intérêt à utiliser des solutions diluées pour être dans les conditions de validité de cette loi, car à une certaine concentration(élevée), on n'a plus cette proportionnalité.
pour la question de BeforeDaylight, je crois que les puits colorés traduisent une réaction positive aussi bien dans Elisa directe que indirecte, puisque la coloration signifie la fixation des anticorps couplés à une enzyme

[invite802886a4]

bonsoir,d'abord merci foulifi,en fait mon erreur si situait au niveau de la fonction DO=f(1/dilution),car avant j'utilisais do=f(dilution),avec l'excel on est sûr d'avoir les bonnes valeurs.et poiur la do du bradford en fait c'est parceque le bleu de comassie devient bleu en réagissant avec l'argenine et l'hystidine mais beaucoup plus avec l'argenine c'est pour cela qu'il absorbe a 595nm.voila merci et a bientot.

[invitedd60a00b]

c'est parceque le bleu de comassie devient bleu en réagissant avec l'argenine et l'hystidine mais beaucoup plus avec l'argenine

Bonjour, si tu parles des acides aminés, je crois que c'est l'arginine et l'histidine.

[invite802886a4]

bonsoir,
exacte veuillez excusez mon orthographe , j'etais fatiguée.
merci