bonjour à tous!
j'ai une lecon à faire sur les protéines membraines et j'aimerai au tout début démontrer leur existance (meme si je vous avoue que c'est, je pense, evident pour bcp!)
je pensais au cryodécapage pour les mettre en évidence mais auriez vous d'autres idées?
je pensais aussi à la fluorescence mais est ce vraiment possible?
merci à tous
clémence
Dernière modification par piwi ; 27/02/2008 à 15h46.
Salut
LA miscroscopie confocale en effet devrait te permettre cela, mais moi je pencherai plus vers la microscopie electronique apres immunomarquage aux billes d'or.
Sinon tu peux tenter une experience de fractionement cellulaire, et tu montres par western-blot que ton anticorps reagit avec la fraction membranaire.
Yoyo
Bonsoir,
Tu peux très bien le faire par bombardement pour faire de la colocalisation avec de la RFP et de la GFP par exemple et observé au microscope si il y a superposition des fluorescences avec un organite de la cellule, ainsi tu pourra conclure que ta protéine est membranaire et se fixe à tel ou tel organite.
C'est ce que je fais actuellement avec la partie transmembranaire de mon enzyme.
Et ca marche bien
Salut,
Je trouve que le fractionnement cellulaire est le plus simple, le moins cher et le plus rapide. Tu separes tes membranes des autres organites, tu migres un gel, puis soit WB, soit coloration au coomassie.
Les autres methodes ennoncees, sont certes nettement plus jolie, mais aussi beaucoup plus dure a realiser !
A+
merci à tous!!
je vais pouvoir plancher plus sérieusement sur mon cas!!!!
Salut a tous,
effectivement le fractionnement cellulaire est tres beau en theorie mais eske quelqu'un a un vrai bon protocol permettant de separer les 3 fractions Cyto/Noyau/membranes?
merci a tous
Bonjour!
Oui j'ai un bon protocolle de fractionnement cytosol/membrane qui fonctionne très bien...
Pour plus d'info : MP
V.
oh c'est une super nouvelle dis donc!!
Si il est possible de l'avoir.....
Je pensais blotter la caveolin comme control membranaire, aurais-tu autre chose a me suggerer?...un proteine exclusivement cytosolique? ou nucleaire? C'est pas forcement evident je trouve.
merci bcp
Je t'ai envoyé le proto par MP.
Comme je te l'ai dit, j'utilise Ras comme contrôle de membrane et Erk total pour le cytosol.
V.
Re : mise en evidence des protéines membranaires
Merci Vinc,
le protocol a bien marche, je peux voir ce que je voulais
Super!!!
Tu me mettras en deuxième auteur!
V.
je pense que je suis encore un peu loin du papier mais qui sait!!
salut
deux petites questions.
Ca separe le cytosol de toutes les membranes? que la protéine soit dans la vacuole, le golgi ou le RE c'est bon?
Est-ce que le protocole marcherai sur des levures?
Yoyo
Théoriquement ca sépare la partie cytosolique des parties membranaires donc endosomes compris. Mais tu as une première centrifugation pour enlever les débris et les noyaux. Peut-être que tu vas descendre du RE avec... Dans ce cas là il faudrait optimiser la centrifugation, voir la lyse.
Pour isoler le Golgi ou d'autres organites c'est plutôt du fractionnement subcellulaire et donc pas le même protocole. Le protocole que j'utilise fonctionne très bien et est idéal pour avoir une première vision de la localisation, mais si tu veux affiner il faut changer de protocole.
Après est ce que ca marche sur les levures, je ne sais pas, il faut essayer. Je pense que tu risques d'avoir des problèmes pour casser les cellules au dounce (les levures étant plus petites que les cellules de mammiffères). Est ce que la lyse hypotonique fonctionne sur la levure?
V.
merci pour ta reponse. en fait j'ai une protéine qui est censée etre membranaire (vacuole)...et je me demande comment je pourrai etudier sa localisation et sa topographie plus en detail.Envoyé par Vinc
Non la levure n'est pas sensible a la lyse hypotonique, elle a une paroie relativement epaisse et est donc difficile a casser.Après est ce que ca marche sur les levures, je ne sais pas, il faut essayer. Je pense que tu risques d'avoir des problèmes pour casser les cellules au dounce (les levures étant plus petites que les cellules de mammiffères). Est ce que la lyse hypotonique fonctionne sur la levure?
V.
YOyo
Le fractionnement cytosol/membrane n'est pas le bon outil si tu sais déjà que la protéine est dans les vacuoles. Tu peux essayer le fractionnement subcellulaire mais c'est loin d'être simple, donc je pense que l'IF reste le meilleur moyen pour répondre à ta question....
C'est bien ce qui me semblait. On ne peut pas lyser autrement je pense si on veut faire du fractionnement dérrière.
V.
salut
ca va etre chaud alors....
Sinon ta deja fait des etudes de topologie d'une protéine membranaire?
Yoyo
Salut!
Pas forcément! Enfin les approches biochimiques de localisation sont assez compliquées surtout en ce qui concerne les marqueurs des différentes fractions. Si tu fais de l'IF c'est peut-être un peu plus facile... Mais je pense qu'il faut faire du confocal par contre.ca va etre chaud alors....
Non jamais désolé
V.
