colonne de Nickel et Tampon phosphate

[mimosa]

Bonjour tous le monde,
Un petit problème de manip ma bloque depuis qq jours. j'ai fait exprimer une enzyme recombinante His-Taggée chez E. coli et j'arrive à la purifier en feasnt une colonne de Ni suivie d'une chrommato d'exclussion. jusqu'ici j'ai travaillé en tampon Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM. mon problème est que dans ce tampon ma prot ne supporte pas la concentration avant chrommato d'exclusion, elle perd enorémént d'activité. dans la littérature j'ai trouvé que cette prot recombinante (venant d'autres organismes mais présentant un fort pourcentage d'identié avec la mienne) se concentre bien en tampon phosphate. cependant personne ne parle de colonne de Ni en tampon phosphate... Est-ce possible, est-ce que quelqu'un l'a déjà fait ?
PS : Ma prot n'aime pas beaucoup la dialyse non plus, c'est pour cela que je voudrais travailler en tampon phosphate dès le départ.
Merci d'avance.
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[gorben]

Salut,

Le tampon phosphate permet de "forcer" un peu le binding des proteins reticentes... En fait le binding sur Ni se fait plus facilement, mais tu te retrouves souvent avec beaucoup de non-specifique.

As tu essaye de placer le tag de l'autre cote de ta proteine? Perso j'ai deja fais l'experience d'une proteine avec un tag Nt qui se retrouvais replie a l'interieur de la proteine, et donc lors de la purif, ma proteine etait denaturee pour pouvoir se fixer sur le Nickel. En mettant le tag en Ct, j'ai resolu tous les problemes !!!

A+