Bonjour,
J'aimerai savoir si quelqu'un pouvait me conseiller un vecteur d'expression pour mammifère dans le but de sur-exprimer un gène de façon stable dans des cellules humaines. Un vecteur non inductible et taggé à l'eGFP ou à la luciférase serait le top. En effet, il en existe un grand nombre sur le marché et je ne sais lequel choisir.
De plus, peut-on me conseiller sur des agents transfectants (lipofectamine...).
Merci de votre aide
J'aimerai également savoir si je dois tagguer ma protéine en N ou C terminal?
Merci
pour cette question il n'y a pas de réponse standard. Ca depend de ce que tu veux faire et de ta protéine.Envoyé par stonpz38
Tu n'as généralement pas d'autre choix que de tester les deux possibilités.
YOyo
Salut,
Je suis en train de faire des clonages également. J'utilise un pcDNA3.1 et un pCI-neo. Les miens sont non-inductibles, par contre, ils n'ont pas de GFP. Je suis quasiment sûr que tu puisses en trouver des tagués.
Sinon, j'utilise un vecteur pd2-eGFP-N1 qui est pas mal du tout. Je l'utilise pour calculer le taux de transfection en transitoire, mais il me semble qu'il possède un MCS en phase, et je pense que tu pourrais cloner ta séquence dedans.
Par contre, je sais pas si tu as déja essayé d'exprimer en stables une protéine, mais moi j'ai quelques soucis...
J'ai cloné un cDNA humain d'un gène codant un facteur d'épissage alternatif dans un vecteur et je l'exprime en stable dans des cellules C2C12 (souris). Et bien mon taux d'expression de l'exogène est extrèmement faible par rapport à l'endogène de souris, et ça en ARN et prots... Après plusieurs mois passés dessus, j'en ai conclu qu'il y avait surement une autorégulation qui fait baisser le taux exogèné...
Donc, si t'as la possibilité, essaye peut-être un vecteur avec promoteur inductible, pour ne pas trop "destabiliser" tes cellules...
C'est quoi la protéine que tu veux exprimer ?
Bonjour,
Merci de vos réponses.
J'aimerai sur-exprimer la cycline E dans des cellules humaines.
Tu voudrais l'exprimer en continu ? Ce n'est pas oncogène ?
Jean-Luc
La violence est le dernier refuge de l'incompétence.
Salvor Hardin
Salut,
Remarque dans le sens de la question de J Luc : Il me semble que la cycline E intervient dans la régulation du cycle cellulaire... Donc l'exprimer (en plus sous le contrôle d'un promoteur fort) est pour moi assez difficile, je pense que les cellules qui vont exprimer cette prot vont être complètement dérégulées, ou il y aura une modification de l'expression de ta prot exogène pour minimiser son effet néfaste et tu ne sélectionneras que des clones qui l'exprimeront peu ou pas du tout.
Pour moi, l'inductibilité est indispensable dans ce genre de cas.
C'est pour faire quoi au final avec ta prot ? Purifier des complexes ?
j'aurais une autre idée si ça merde un peu, peut-être du RNAi contre l'endogène, de façon à exprimer l'exogène... maintenant, faut voir l'efficacité sur le type cellulaire que tu utilises...
Si c'est pour voir ta prot ex vivo, pourquoi pas faire en transitoire ?
Oui, le but de ma manip est de sur-exprimer en continue la cycline E (qui intervient effectivement dans le cycle cellulaire: transtion phase G1/S) dans mes cellules. Une approche par siRNA est également en cours.
