Bandes d'électrophorèse disparaissant ...

[invitea71c95d8]

Bonjour à tous

J'ai rencontré durant un stage deux problèmes lors de la révélation de gels d'électrophorèse sous UV :

1// Parfois (ça m'est arrivé 2 fois en fait), les bandes fluorescentes disparaissent très vite sous UV, càd en une trentaine de seconde ...

2// Un halo de fluorescence apparait autour des colorants du tampon de charge. On a eu le problème avec le Orange G contenu ds le tampon de Promega, avec la formation d'un halo bleu ciel assez intense qui masquait les bandes. J'ai donc refait un tampon de charge contenant uniquement du bleu de bromophenol, et là pareil, en moins intense. Ds ce dernier cas c'était moins génant vu que la bande amplifiée ne se situe pas au meme endroit. Je sais que par exemple le Orange G émet sous UV, mais est-ce normal que ça le fasse autant ?! Faut-il laisser baigner le gel plus lgtps ds l'eau pr éliminer les restes de BET ainsi que le colorant ?!


Qques infos qui vous aideront peut-etre à comprendre : on utilise des réactifs Promega pour faire une PCR, de l'eau ultra-pure pour les mixes, le tampon de migration, le tampon de charge et le gel. Ce sont des gels d'agarose à 1 ou 2%. Tampon de migration = TBE 0,5X. Après migration on trempe le gel ds un bain de BET pdt 20-30min puis 20-30min ds l'eau (rinçage), avant de révéler sur tablea UV (Fisher Scientific).


Voilà j'espère que ce sujet n'a pas déjà été abordé ... et que vous aurez des solutions

Merci à tous, ciaoOo

benji
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[invitec9f0f895]

salut

j'ai pas tout compris a ton histoire de hallo, en revanche pour tes bandes qui disparaissent c'est lié au fait que la longueur d'onde des UV que tu utilises n'est pas adaptée a l'observation de l'ADN!
Les UV cassent les molecules qui disparraissent dans ton gel.

YOyo

[invitea71c95d8]

OK merci de la réponse. Ce qui est troublant c'est que d'autres utilisant la meme table UV n'ont pas eu de pb, et que meme moi ça m'est arrivé que 2 fois pourtant utilisant la meme table UV ... De toute façon je ne sais meme pas si on peut régler la longueur d'onde sur ce genre de table.

Pr l'histoire de halo : en fait, on utilise un tampon de charge qui contient trois colorants : xylene cyanol, bleu de bromophenol et orange G (Promega), les trois migrants environ à 4000, 300 et 50pb environ, respectivement. Quand on révèle sous UV, les taches correspondant aux colorants sur le gel sont sombres et ne genent en général pas la révélation, elles masquent légèrement ms rien de grave. Le problème dans mon cas c'est que le orange G, une fois, a émis de la fluorescence bleu sous UV, sous forme d'un halo bleu ciel entourant la tache de colorant. Sur Wikipedia j'ai vu que l'orange G émet sous UV ds le bleu ciel, ce qui colle. Je me demandait dc d'une part pk mettre un composé qui émet sous UV ds un marqueur qui passe sous UV après ?? ou bien il faut éliminer le colorant sdle bain d'eau ? ou peut-etre est-ce une histoire de longueur d'ondes ?
En tout cas j'ai fait un tampon de charge ne contenant que du bleu de bromophenol pr éviter ce pb, ms là le bleu a aussi fluorescé, bcp plus légèrement, ds le bleu-gris. Ca n'a pas trop géné ms jvoulais savoir pourquoi ...

Voilà j'espère avoir été plus clair

Merci ciaoOo

[Jean-Luc P]

La disparition peut aussi être due à un phénomène de photoblanchiment du fluorophore.

Mais bon avec le BET il faut mettre un paquet d'UV pour le constater... A mon avis soit tu ne mets pas assez de BET dans tes gels, soit tu n'as aps assez de matériel, soit ta lampe est trop forte (ou la longueur d'onde pas adaptée).

Je ne crois aps trop aux cassures de l'ADN, ça se produit certes mais pas si vite.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec9f0f895]

en effet la quantité de BET dans ton gel pourrait etre une expication

Je ne crois aps trop aux cassures de l'ADN, ça se produit certes mais pas si vite.

Pourtant j'ai un temps utilisé une mauvaise lampe UV et j'ai vu moi meme les bandes disparaitre dans le gel!!!

Yoyo

[invitea71c95d8]

Bonjour,

problèmes de lampe UV ou de BET ça m'étonnerais, puisqu'une autre personne utilise la meme table, le meme bain de BET (meme durée ds le meme bain ...) et n'a pas eu ce problème.

Par contre c'est vrai que le gène qu'on a amplifié paraissait peu exprimé (on a fait une extraction d'ARN puis RT et PCR sur ADNc) puisqu'on avait toujours une bande très faible ... Arf mais j'y pense à l'instant, le ladder aussi disparaissait dc ça peut aps etre ça ...

Est-ce que ça peut etre du à une molécule ou une condition qui dégraderait l'ADN et/ou le BET ?!

[invitee863e61a]

Bonjour,

problèmes de lampe UV ou de BET ça m'étonnerais, puisqu'une autre personne utilise la meme table, le meme bain de BET (meme durée ds le meme bain ...) et n'a pas eu ce problème.

Par contre c'est vrai que le gène qu'on a amplifié paraissait peu exprimé (on a fait une extraction d'ARN puis RT et PCR sur ADNc) puisqu'on avait toujours une bande très faible ... Arf mais j'y pense à l'instant, le ladder aussi disparaissait dc ça peut aps etre ça ...

Est-ce que ça peut etre du à une molécule ou une condition qui dégraderait l'ADN et/ou le BET ?!

Oui...les UV dégradent l'ADN (étonnant, non?). Et puis 30s sur une table, c'est bcp!