Différence entre tween, triton x, NP ... ?

[invite947abf84]

Bonjour à tous,

J'ai une question de novice, j'en suis sûr, mais qui m'eclaircirai beaucoup quand au choix judicieux d'un detergent.
Voilà, je voudrai utiliser un detergent non ioniques (le moins dénaturant possible pour mes protéines) pour diminuer les adsorptions non specifiques d'anticorps ou autre protéines d'interet sur un test qui se rappoche de l'ELISA.
J'ai pour l'instant utilisé du Tween 20 avec de relativement bon résultats. Le problème c'est le temps de lavage nécéssaire pour ce résultat !
Est possible de diminuer le temps et le nombre ds lavages en gardant une efficacité correcte ?
J'ai vu qu'il existait plusieurs types de tween (20, 80, etc...), de tritons x (100, 114, 405, etc...) ou de NP. Quelles sont les différences entre toutes ces variantes ??
Sinon est-ce possible d'utiliser de la BSA ou des protéines de lait (ou autres) pour mes lavages ??


MERCI d'avance pour vos réponses à un nouveau dans ce domaine !!

A bientôt
Polyclonal
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[invite947abf84]

pas de réponses ??

sûr ?
... bon...

[piwi]

En général pour les lavages il est préférable d'en fait plus que pas assez. Si tu veux réduire les temps de lavage tu peux essayer de les multiplier. Plutot par exemple de faire 3x 20 minutes tu peux tenter de faire 4 ou x 10 minutes. Dans pratiquement tous les cas tu peux faire un premier lavage rapide (quelques secondes). Ca élimine l'excedant et ensuite tu peux raccourcir les autres lavages. Ainsi tu peux, en gardant le premier exemple de 3x 20 mins, remplacer par lavage rapide, 4 x 10 mins.
En fait le lavage est à considérer un peu comme une dialyse. Un equilibre se crée entre le déplacé et le non déplacé. Donc dans le premier lavage tu enleve tout de suite beaucoup d'où le fait qu'il n'a pas à durer une éternité. Les autres sont plus long à venir jusqu'a un équilibre.

En général pour les détergents on a un corps et une chaine aliphatique. Le chiffre se réfère à la chaine aliphatique, plus le chiffre est grand plus la chaine est grande et plus le pouvoir détergent sera grand.
Ainsi pour le Tween le corps est formé par du polyoxyethylene (20) sorbitan (C'est bôôôôôô!!!). Pour le tween 20 la queue c'est du laurate alors que pour le tween 80 c'est de l'oleate.
Courament pour des manip avec des protéines on utilise du PBS-tween 20 0.05%-0.1% ou du PBS-triton X100 0.1% (note que tu peux remplacer le PBS par du TBS (Tris buffer salin), des fois ca peut aider). En théorie on peut utiliser un blockage au régilait ou à la BSA. Le risque c'est que si tu rinces mal tu vas conserver des agrégats qui vous générer du bruit de fond plus qu'ils n'en retirent. C'est pourquoi je ne te le conseille que si tu peux rincer dans de grands volumes (nous on a cessé de bloquer pour les immunohisto par exemple). Dans ton contexte (des cupules normalement en ELISA) tu prendrais un risque de conserver des agrégats et (1) de conserver des saloperies dans tes puits qui génereraient du bruit de fond en liguant les anticorps (2) de fausser tes DO du simple fait de leur présence.

Conclusion:
Tu peux tenter d'optimier tes rincages en jouant sur le temps et le nombre.
Tu peux tenter de concentrer un peu ton Tween-20 (passer de 0.05% à 0.1% voir à 0.2%)
Tu peux tenter de changer le PBS par du TBS
Si tes résultats sont nets mais avec du bruit de fond, tu peux aussi essayer de diluer un peu plus ton anticorps primaire

Cordialement,
piwi

[invite947abf84]

Ciao Piwi,

Je ne vois ta réponse que maintenant.

Merci beaucoup de m'avoir éclairé sur les lavages. Je vais tester ces quelques manips dès maintenant. En fait j'utilise généralement de la BSA pour bloquer avec des lavages au PBS tween 20 0.1%. Je vais donc essayer les autres combinaisons buffer/detergent et changer les temps de lavages et nombres.

Merci encore et à une prochaine sur le forum.

Polyclonal

[A voir en vidéo sur Futura]