Beta galactosidase chez Saccharomyces cerevisiae

[invite3d0376e4]

Bonjour à tous!
Je viens demander de l'aide, si quelqu'un pouvait m'éclairer ce serait génial...
Je vous explique mon problème : je cherche à exprimer la betagalactosidase chez S. cerevisiae, mais sous la dépendance d'un promoteur faible (URA3 delta UAS) qui est androgénodépendant. Il a en amont 3 éléments de réponse aux androgènes. J'ai intégré le vecteur d'expression de la betagalactosidase au génome de ma levure et je transforme ensuite celle-ci avec un vecteur portant le gène du récepteur des androgènes (le but étant de tester différents récepteurs mutés). J'ai aussi essayé en mettant en amont du gène lacZ le peptide signal de l'invertase. Mais en mettant les levures en culture en présence de X-gal je n'ai aucune coloration...
Il y a-t-il une manip ou une séquence spécifique à introduire dans la levure pour que la betagalactosidase soit exprimée?
Je vous remercie d'avance
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[piwi]

Salut,

Question super idiote mais t'as vérifié que tes plasmides rentraient bien dans tes levures? En un mot t'es certain d'avoir un bon taux de transfection?

Autre question à l'épreuve des balles: t'es certain que ton gene beta gal est bien intégré et qu'il est en phase? Pas une petite délétion due aux enzymes de restriction durant le clonage? La même question vaut d'ailleurs pour ta construction. Ton récepteur est bien synthétisé, y a pas de souci de phase?
Sinon t'as fais un test avec des cellules qui synthétisent des androgènes spontanément? (Je sais pas si ca existe) Ca permettrait de voir où ca peut chiotter.

Sinon t'as essayé de lyser tes cellules et de faire un test en plaque à l'ONPG? C'est plus sensible que le X-Gal je crois.

Cordialement,
piwi

[invite3d0376e4]

[QUOTE=piwi;1302490]Salut,

Salut,

Merci d'avoir répondu!

Question super idiote mais t'as vérifié que tes plasmides rentraient bien dans tes levures? En un mot t'es certain d'avoir un bon taux de transfection?

Mes plasmides entrent bien dans mes levures, j'ai un gène de sélection sur le plasmide qui est TRP1 et mes levures sont auxotrophes pour le tryptophane...

Autre question à l'épreuve des balles: t'es certain que ton gene beta gal est bien intégré et qu'il est en phase? Pas une petite délétion due aux enzymes de restriction durant le clonage?

Là même chose, j'ai réalisé ma construction de telle sorte à ce que mes fragments peptide promoteur, peptide signal et beta gal soient en phase, j'utilise pour celà des sites de restriction bien sûr, mais j'ai vérifier avant de faire mon clonage...

La même question vaut d'ailleurs pour ta construction. Ton récepteur est bien synthétisé, y a pas de souci de phase?

Oui c'est bon aussi de ce côté, j'utilise mon récepteur dans une autre transfo et ça marche sans problème.

Sinon t'as fais un test avec des cellules qui synthétisent des androgènes spontanément? (Je sais pas si ca existe) Ca permettrait de voir où ca peut chiotter.

Ce type de cellule n'existe pas, mais je pensais mettre ma construction sous dépendance d'un promoteur fort, juste pour voir si c'est exprimé ou pas...Par contre si ça ne l'est pas, je ne saurai plus trop quoi faire, car j'ai des publi où ce système fonctionne mais sous dépendance d'un autre promoteur faible le CYC 1 (promoteur du cytochrome chez la levure)...

Sinon t'as essayé de lyser tes cellules et de faire un test en plaque à l'ONPG? C'est plus sensible que le X-Gal je crois.

Oui j'ai essayé de lyser et d'utiliser le S-gal, je n'ai aucune coloration...


S'il vient une idée à qq'un n'hésitez pas!

[Yoyo]

Salut

bon tout d'abord le X-gal ne penetre pas dans la levure, donc pour utiliser le X-gal la seule maniere est de faire un "top-agar". c'est a dire tu traites tes colonies au chloroforme puis tu coules dessus un agar contenant du X-gal. tu mets le tout a 30 et tu attends de voir ce qui deviens bleu.

Sinon plus directement, tu fais une culture de tes levures, tu culottes puis tu casses au billes de verre et au vortex. Tu prends l'extrait tu mets dans le tampon Z et en presence d'ONPG puis tu prend la DO a 420nm.

Je ne sais pas si ce promoteur URA3 est fort ou non, mais si c'est un promoteur faible tu risque de devoir attendre 4h avant de voir un peu de jaune apparaitre!
Sinon une question, est-ce que le promoteur URA3 ne serait pas reprimer en presence d'uracile ? ca pourrait expliquer pourquoi ton promoteur n'est pas actif alors que CYC1 fonctionne. Ca depends aussi si tu as de l'uracile dans ton milieu de culture.

YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]