Cartographie des DSB par ChIP...

[invite17a570c1]

Bonsoir,

J'ai eu un cours sur la recombinaison homologue aujourd'hui. On parlait de la cartographie des régions les plus propices aux cassures double-brin (DSB) chez S. cerevisiae. Notre prof nous a dit que ces régions ont été cartographiées sur tout le génome grâce à la technique ChIP et nous a montré un tout petit transparent pour qu'on ait une idée grossière de quoi il s'agissait.

En gros, il s'agit de prendre un mutant de S. cerevisiae Rad50s (qui a la particularité de ne jamais réparer les DSB causées par la nucléase Spo11 qui reste fixée à l'ADN à l'endroit de la coupure) -> de lier de manière covalente un peptide HA à la Spo11 et de rajouter des anticorps dirigés contre HA -> purification. Et c'est là qu'on décide ce que l'on fait : puisque ce pool de de fragments d'ADN marqués est petit, on peut amplifier par PCR et déposer les amplifiats sur gel (= ChIP-PCR) ou directement hybrider sur lame de verre (ChIP-on-chip).

Ce que je n'ai pas compris c'est comment on décide de faire de la ChIP-PCR ou de la ChIP-on-chip... Je veux dire la quantité de fragments marqués sera toujours petite, pourquoi dans certains cas on amplifie et pas dans d'autres?

Merci pour vos éclaircissements.

Cordialement,
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[invitec9f0f895]

Salut

parceque dans certains cas tu souhaites etre quantitatif alors que dans d'autre cela n'a pas d'importance. Or si tu passes par une etape PCR plus rien n'est proportionel.

YOyo

[invite17a570c1]

Merci, Yoyo!

Mais comment ça, proportionnel?
Et il n'y a pas un seuil de sensibilité pour les puces? Je veux dire, ces régions DSB semblent être rares, donc les fragments marqués ne doivent pas être très nombreux...

Je ne connais pas du tout cette technique, donc je n'y comprends pas grand-chose, désolée

Cordialement,

[invitec9f0f895]

Si tu passes par une etape PCR tu ne pourra pas savoir si un site est casse dans 80% des cas ou dans 1% car les PCR sont faites a saturation (a moins de faire une PCR en temps reel).

Yoyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite17a570c1]

Si tu passes par une etape PCR tu ne pourra pas savoir si un site est casse dans 80% des cas ou dans 1% car les PCR sont faites a saturation (a moins de faire une PCR en temps reel).

Yoyo

Ah ok! Il n'est pas précisé dans mon cours s'il s'agit d'une PCR en temps réel ou pas... Mais alors, s'il s'agit d'une PCR classique (donc qualitative), quel intérêt? Je veux dire, le fait d'avoir des fragments marqués par immunoprécipitation me dit que j'ai cassure et l'hybridation sur lame de verre me dit où exactement elle est située. Donc, pourquoi faire une ChIP-PCR?
Merci beaucoup!

Cordialement,

[invite17a570c1]

Bonjour,
Je remonte brièvement ce fil pour dire que j'ai pigé La réponse peut être utile à d'autres dans le future

Donc, en fait dans cette technique on ne fait que de la qPCR pour quantifier les cassures et l'hybridation sur lame de verre sert à identifier la zone génomique où les cassures se produisent.

Merci, Yoyo, pour le mot "proportionnel"! Très très utile pour réfléchir.

Cordialement,