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Isolement d'un compartiment cellulaire



  1. #1
    Tekila38

    Isolement d'un compartiment cellulaire

    Bonjour à tous !!!

    Voila je dois préparer un TP de bio cellulaire, mais je bloque sur quelques questions auquelles je ne trouve pas de réponse en surfant qur internet... Pouvez-vous m'aider? ( Il bon de savoir aussi que je suis vraiment mauvaise en bio cell.... )

    Alors voila : le but du tp est l'isolement de chloroplaste (épinard)

    Les premières questions sont
    1) Qu'apelle-t-on fractionnement cellulaire?
    2) Quelles sont les principales techniques de fractionnement?
    3) Pour quelles structures sont-elles utilisées?

    Je n'ai trouver aucunes informations précises sur ces 3 questions..

    Ensuite au niveau manipulation, on procède à une extraction et à un gradient (dont j'ai pas compris le but ^^):
    On utilise pour cela: 200g de feuilles d'epinard + un milieu de broyage(saccharose 0.3M, pyrophosphate de Na 30mM, pH 7.8) que l'on broye 3fois 3 secondes.Ensuite on filtre l'extrait brut et on repartit le filtrat dans 6 tubes de 85 mL que l'on centrifuges.On elimine ensuite le surnageant puis le culot des chloroplaste est remis en suspension (suspension S1) dans 1 mL de milieu de broyage. On rassemble ensuite tous les culots dans un tube de 15 mL.
    En parallèle nous effectuons un gradient : on depose 16mL de Percoll 90% dans une chambre et 16mL de tampon de lavage dans la deuxieme chambre. On ouvre un robinet de communication entre les deux chambres et on declenche une homogeneisation. On remplit des tubes (j'imagine au nombre de six ?!?) jusqu'à 25mL.
    Lorsque le gradient de Percoll est terminé, on depose 1mL de S1 au sommet de chaque gradient. Les chloroplastes sonr purifiés par centrifugation sur gradient.(en parallèle on effectue une centrifugation en deposant 1mL de milieu de broyage et 15µL de marqueurs de densité colorés au somment d'un second gradient (là aussi je ne voit pas l'utilité....))
    On élimine ensuite le tampon et la bande superieure corespond aux chloroplastes cassés.On récupère les bandes de chloroplastes intacts et purifiés (suspension S2).

    Alors tout d'abord une question : à quoi sert un gradient?

    Ensuite on en revient aux questions de mon Tp:
    4) justifier le materiel de depart. (personnellement je ne vois pas quoi repondre a cette questions car on à que du materiel banal pour de la biologie...)
    5) Quel materiel auriez-vous choisi pour isoler des mitochondries? (la encore n'ayant pas compris à quoi servait un fractionnement, je ne sais pas s'il faut un materiel spécifique aux mitochondries....)
    6) Quel est le rôle du milieu de broyage? (j'ai trouver que la saccharose permettait de garder l'intégrité des chloroplastes, mais je n'ai rien trouver de particulier pour le reste)
    7) On nous demande d'observer des chlroplastes de S1 et savoir si cette observation est suffisante pour apprécier la pureté de l'échantillon en connaissant la taille d'un chloroplaste. (J'imagine que vu la taille des chloroplastes il est impossible a l'oeil nue de vérifier cette pureté).
    On nous demande alors quelle technique nous semblerait plus appropriéé?

    Voila j'en arrive a la fin. Je remercie tous celles et ceux qui on eut le courage de lire jusqu'au bout cette interminable description de Tp
    Et remercie encore plus fortement toutes celles et ceux qui auront pris la peine de répondre à mes questions.
    Je vous assure que j'ai fait des recherches sur le net, que j'ai déjà trouver quelques informations et que toutes les questions que je vous posent ici, sont celles restées sans réponse...

    Merci et bonne soirée

    -----


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  3. #2
    BioCell

    Re : Isolement d'un compartiment cellulaire

    Citation Envoyé par Tekila38 Voir le message

    Les premières questions sont
    1) Qu'apelle-t-on fractionnement cellulaire?

    3) Pour quelles structures sont-elles utilisées?



    On récupère les bandes de chloroplastes intacts et purifiés

    pour isoler des mitochondries?
    La réponse est dans la question.... on peut isoler des noyaux aussi par fractionnement.
    Le gradient est un gradient de densité, tu peux donc en déduire à quoi il sert..

    Bon courage
    Je tatonne, je tatonne ...et point ne trouve (F'MURR)

  4. #3
    Tekila38

    Re : Isolement d'un compartiment cellulaire

    Du coup le fractionnement cellulaires, c'est fait pour qui? Pour toutes les types d'organites? chloroplastes, mitochondries, noyau...?

    Et tu coup, le materiel est-il different entre chloroplastes et mitochondries?

    Pour le gradient de densité, grâce à la couleur donné de solution de chloroplastes on peut connaitre la concentration,non?
    Mais est-ce bien fiable?

  5. #4
    BioCell

    Re : Isolement d'un compartiment cellulaire

    Citation Envoyé par Tekila38 Voir le message
    Du coup le fractionnement cellulaires, c'est fait pour qui? Pour toutes les types d'organites? chloroplastes, mitochondries, noyau...?
    En fait, le fractionnement subcellulaire sert à isoler les différents compartiments d'une cellule:noyau, mito, golgi etc..
    Je tatonne, je tatonne ...et point ne trouve (F'MURR)

  6. #5
    BioCell

    Re : Isolement d'un compartiment cellulaire

    En ce qui concerne le matériel de départ, il faut peut etre justifier le type de cellules utilisé en fonction de l'organite recherché. Donc, pour isoler des mito, des cellules riches en mito...
    Le gradient sert à isoler les éléments en fonction de leur masse, en adaptant la vitesse de la centri pour culoter les éléments les plus lourds et garder les autres en suspension.
    Par exemple, pour mes fractionnement (lympho B), je tourne à 500g pour récupérer un culot de noyaux et je recentrifuge à 1500g pour faire tomber les mito. Le surnageant est alors composé du cytosol+membranes.
    J'espère que tu y vois un peu plus clair dans le fractionnement.
    Je tatonne, je tatonne ...et point ne trouve (F'MURR)

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Tekila38

    Re : Isolement d'un compartiment cellulaire

    Bon alors après avoir continuer mes recherches et les renseignements fournis sur ce forum je possède plusieurs elements de réponses, mais je sais pas s'ils sont justes....

    1) Qu'apelle-t-on fractionnement cellulaire?
    -c'est une technique de séparation des différentes parties d'une cellule au moyen d'une homogénéisation puis d'une centrifugation differentielle pour donner des fractions nucléaires, mitochondriales, microsomale et des fractions solubles.

    2) Quelles sont les principales techniques de fractionnement?
    -homogénéisation et centrifugation
    -à l'aide de solvant organique: dissolution des membranes lipidiques
    -détergents (anioniques, non-dénaturants): solubilise les membranes en interagissant avec les bicouches lipidiques.
    -digestions enzymatiques.

    3) Pour quelles structures sont-elles utilisées?
    -j'aurais dit pour tous types de cellules contenant des proteines (car fractionnement avec solvant, detergents et digestions enzymatique...) mais y a-t-il des proteines dans les chloroplastes ?!?

    4) Justifier le materiel de depart.
    -toujours aucune idées, a part la remarque de BioCell comme quoi les feuilles d'épinards sont riches en chloroplastes..

    5) Quel materiel auriez-vous choisi pour isoler des mitochondries?
    -des individus riches en mitochondries, mais c'est à dire? Les feuilles d'épinards ne sont-ils pas riches en mitochondries?

    6) Quel est le rôle du milieu de broyage?
    -saccharose : permet de garder l'intégrité des chloroplastes
    -pyrophosphate de Na :
    -pH 7,8 :

    7) On nous demande d'observer des chlroplastes de S1 et savoir si cette observation est suffisante pour apprécier la pureté de l'échantillon en connaissant la taille d'un chloroplaste.
    -la taille des chloroplastes est trop petite pour les voir à l'oeil nue et donc on ne peut pas vérifier la purete comme ça.
    On nous demande alors quelle technique nous semblerait plus appropriéé?
    -observation au microscope de la fFraction brute de chloroplastes isolés observés en contraste de phase.
    Les chloroplastes intacts pourvus de leur enveloppe apparaissent brillants. Les chloroplastes "cassés" dépourvus de leur enveloppe apparaissent sombres.
    - ...

    Voilà ou j'en suis de mes recherches. J'espère que vous pourrez encore m'aider s'il vous plait pour les questions un peu "tordues" ^^
    Merci

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  10. #7
    Tekila38

    Re : Isolement d'un compartiment cellulaire

    Personne ne veut m'aider?

  11. #8
    BioCell

    Re : Isolement d'un compartiment cellulaire

    mais y a-t-il des proteines dans les chloroplastes ?!?

    A quoi sert un chloroplaste, d'après toi? S i tu réfléchis 2 secondes, tu trouveras toi meme s'il y a (ou pas) des protéines dans les chloroplastes.
    Je tatonne, je tatonne ...et point ne trouve (F'MURR)

  12. #9
    BioCell

    Re : Isolement d'un compartiment cellulaire

    Sinon, pour la pureté de mes fractions, je fais un western blot pout vérifier que je n'ai pas de protéine mitochondriale dans ma fraction cyto, et inversement.
    Sinon, pour vérifier la pureté en chloroplastes intacts, une observation au microscope me parait une bonne idée.
    Je tatonne, je tatonne ...et point ne trouve (F'MURR)

  13. #10
    Vinc

    Re : Isolement d'un compartiment cellulaire

    Biocell... Qu'est ce que tu utilises comme marqueurs de membrane? As tu déjà fait un fractionnement rafts/membranes hors raft???

    V.
    Primum non nocere.

  14. #11
    BioCell

    Re : Isolement d'un compartiment cellulaire

    Citation Envoyé par Vinc Voir le message
    Biocell... Qu'est ce que tu utilises comme marqueurs de membrane? As tu déjà fait un fractionnement rafts/membranes hors raft???

    V.
    En fait, je ne vais pas aussi loin dans le fractionnement, je m'interesse surtout au relargage de ma prot hors de la mito en conditions apoptotiques.
    Pour le marqueur de membrane, je peux me renseigner auprès de la personne qui m'a filé le protocole si tu veux.
    Je tatonne, je tatonne ...et point ne trouve (F'MURR)

  15. #12
    Vinc

    Re : Isolement d'un compartiment cellulaire

    J'ai déjà plusieurs protos et plusieurs marqueurs mais je voudrai un marquage avec le moins de turn-over possible, vraiment membranaire quoi!

    Je veux bien comparer le tien avec ce que j'ai déjà!

    Merci d'avance...

    V.
    Primum non nocere.

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  17. #13
    BioCell

    Re : Isolement d'un compartiment cellulaire

    Hum, je ne suis pas sure que je puisse t'aider sur ce coup là...
    Ma collègue réalise une ultra-centri à la suite de laquelle elle récupère la fraction "light membrane" (+1 tampon de lyse) (marqueur: dynéine) et la fraction "cytosol" (marqueur caspase 3).
    Je tatonne, je tatonne ...et point ne trouve (F'MURR)

  18. #14
    Vinc

    Re : Isolement d'un compartiment cellulaire

    Elle utilise la dynéine comme marqueur membranaire??? Je parle d emembrane plasmique, et même pour tout ce qui est vésicule voir même endomembrane ca ne me paraît pas être le meilleur choix dans la mesure où la dynéine n'est qu'un moteur, si???

    V.
    Primum non nocere.

  19. #15
    BioCell

    Re : Isolement d'un compartiment cellulaire

    Moi non plus ca ne me parait pas le meilleur choix, mais c'est bien ce qu'elle utilisait (j'ai répété ma question 2 fois pour être sure que j'avais bien compris la réponse...).
    Je tatonne, je tatonne ...et point ne trouve (F'MURR)

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