Bonjour à tous, je travaille actuellement sur un activateur de canal ionique et je pense (pour l'instant toutes les manips confirment ce fait) que la molécule se lie directement aux canaux. Cependant je n'arrive pas à trouver de protocoles (pas trop lourd) pour mettre en evidence ce binding.
Si vous avez des idées, ça m'interesse fortement.
Merci d'avance.
Je suis pas expert du tout mais ...
Tu peux pas faire de l'IP ? Avec detergent doux pour juste casser les membranes ?
Sinon du double hybride non ?
Non car je suppose que la molécule en question n'est pas protéique
V.
En effet la molecule n'est pas proteique, il s'agit d'un composé chimique, ce que je voudrais c'est determiné s'il y a une interaction directe ainsi que le kd. L'IP ou le double hybride ne convient pas.
salut,
Question stupide s'il en est, mais ce "binding" génère t il un produit secondaire??
Je ne sais evidement pas sur quoi tu bosses, mais pourquoi pas isoler tes membranes ( évidement ca dépend les quelles..) et faire le même genre d'expériences qu'on a fait pour montrer la synthèse d'ATP le long du gradient de proton....(varitaion du pH, etc...)
ils avaient fait cela sur en purifiant le produit la membrane interne des mitochondries, et en variant le pH...
De tout évidence, ca peut marcher mais pas avec n'importes quelles membranes et pas avec n'importes quels ions, et pas avec n'importes quels canal ionique.... mais le système est assez simple et efficace...
Amicalement,
Greg
Oui mais non.... Ce type d'expérience ne sert à rien d'autre qu'à montrer que la molécule a un effet sur le canal mais ne démontre en rien l'interaction physique entre les deux. C'est exactement pareil que de montrer le flux ionique après stimulation du canal par la molécule en question : ça montre l'effet final de la molécule sans pour autant montrer l'intéraction.Envoyé par Squalor
Une possibilité, mais c'est loin d'être simple, est de faire de la cristallo mais tu vas t'amuser pour purifier une protéine membranaire qui plus est liée à son substrat..... bon courage
Tu peux également penser au dichroïsme circulaire pour montrer un changement de structure 3D du canal lorsqu'il y a présence de ta molécule. Mais c'est une technique lourde également.
Il existe certainement des logiciels capable de prédire une intéraction entre une protéine et une molécule organique non protéique, mais ca ne reste que prédictif.
Tu peux éventuellement fonctionner par analogie : si tu connais d'autre smolécules ayant été montrée comme intéragissant avec ce canal, tu peux comparer la structure de ces molécules avec celle d'intérêt pour voir si globalement c'est le même type.
V.
EDIT: je ne pense pas qu'il existe de protocolle simple pour montrer l'intéraction physique....
Bonjour!
La nuit porte conseil.... Peut-on envisager un dosage de cette molécule après élution sur un complexe canal purifié/molécule???
Tu montres qu'il n'y a pas ta molécule libre lorsque le canal est là, et tu observes une augmentation de cette molécule après élution, que l'on ne voyait initialement pas car elle était piégée par le canal. C'est indirect mais bon....
V.
Salut,
Tu devrais regarder du cote du BIAcore. Il me semble que tu peux fixer des vesicules ou des membranes sur le chip. Ensuite il ne te reste plus qu'a faire passer ton compose chimique pour suivre le binding en direct (a condition qu'il soit plus gros qu'un sucre simple).
Sinon ben il reste le marquage radioactif du compose chimique, binding, puis lavage, puis comptage...
A+
Ok, merci pour vos conseils, je vais y reflechir serieusement, c'est vrai que pour ce qui est de la cristallo ou du dichroisme ce serait interessant mais impossible à faire niveau finance!!!
Je pense que je vais tenter la dernière proposition de vinc.
Merci à tous et si d'autres idées vous viennent, je suis preneur.
