Bradford / orthotoluidine

[invitef8467885]

Bonjour,

J'aurais simplement aimé savoir quel était l'intérêt, le but de chauffer des solutions à doser (glucides ou protéines + réactif de Bradford ou à l'ortholuidine) avant de mesurer leur absorbance.

Merci.
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[MaliciaR]

Bonjour,

Pourrais-tu être plus précis sur le protocole? Je n'ai jamais fait de quantification par Bradford après chauffage... Tu voulais vérifier quoi?

Cordialement,

[Vinc]

Bonsoir!
Le chauffage permet simplement la dénaturation des protéines.

V.

[MaliciaR]

Beh oui, justement... Le Bradford se fixerait quand même?

Cordialement,

[A voir en vidéo sur Futura]

[Vinc]

Hé bien oui
Le bleu de Coomassie du Bradford se fixe sur les acides aminés donc on imagine facilement que la structure tridimensionelle de la protéine empêche l'accès du Coomassie aux AA. A l'inverse une struture linéaire doit permettre une fixation optimale...

V.

[MaliciaR]

Oui, c'est ce que je me suis dite aussi... Malgré le moment de doute sur l'obligation que la protéine soit fonctionnelle pour que le Bradford s'y fixe...
Mais pourquoi je n'arrive à trouver aucun protocole parlant de chauffage de l'échantillon pour une optimisation de la formation du complexe aa/bleu de Coomassie?
Tout ce qu'on nous a toujours appris à faire c'est laisser le mélange échantillon/Bradford reposer entre 5 min et 1h.
J'ai juste trouvé un truc parlant de dosage d'azote protéique dans les vins, mais les mecs congelaient le truc à -20°C avant de mettre le Bradford

Bref, je suis très intéressée par cette optimisation...

Cordialement,

[invitef8467885]

Merci pour ces précisions,

et dans le cas des glucides pourrais tu m'indiquer pourquoi l'on chauffe la solution (glucides + réactif à l'orthotoluidine) avant de la passer au spectrophotomètre ?

Dans ce cas on chauffe environ 15 min à 90° dans un bain-marie.

Encore merci.