Bonjour à tous.
J'ai fait un TP il y a quelques jours et j'étais en train de rédiger mon materiel et methodes.
Nous avons utilisé 2 techniques : un Western blot et de l'immunocytochimie
Dans le 1er cas nous avons bloquer les sites spécifiques avec dans du tampon TBS (plus lait bien sur) alors que pour l'immunocytochimie, il y avait toujours le lait mais la solution tampon était du PBS...
Savez vous pourquoi on utilise l'un ou l'autre?
Merci
Bonsoir,
je sais que l'on peut aussi utiliser le PBS ou le TBS comme tampon pour l'immunohistochimie. Dans quelles circonstances je ne sais plus. Une chose est sure c'est que ce n'est pas le type technique qui conditionne le tampon mais les réactifs utilisé. Je vais voir demain au labo si je trouve quelques choses qui peut t'aider (uniquement pour l'IHC). Eventuellement si tu peut me donner les références des produits que tu a utilisé ce serait un plus.
A+
Fifikz
Le PBS est utilisé quand on veut être dans des conditions salines physiologiques. Le TBS (tris buffer salin) est utilisé dans le même but mais il permetterait en plus de décrocher les liaisons aspécifiques, il augmenterait donc la stringence.
Il m'est même arrivé d'utiliser du TBS-T (TBS-tween) pour anéantir le plus possible le bruit de fond.
Sous reserve que quelqu'un confirme mes croyances (que je mets en pratique)
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
merci piwi.
Nous avons également utilisé du tween dans les 2 méthodes.
oups j'avais pas vu ton message, Fifikz, désolé.Envoyé par fifikz
Merci de ton aide mais je pense que piwi a répondu à mes questions.
Sinon c'est nous meme qui avons fait les produits :
P(T)BS 1X - tween 20 0,05% - lait écrémé 4%
Oui, idem, on a fait pareil en TP, mais en rajoutant du Tween comme dit Piwi.
Donc, tes croyances, Piwi, sont confirmées
Cordialement,
Salut,
Comme l'a dit Piwi, ce sont deux tampons qui simulent des conditions physiologique. Je ne suis en revanche pas sur au niveau de la stringence. Ce qui est sur c'est que le phosphate du PBS ne fait pas bon menage avec un grand nombre d'autres reactifs, et que c'est pour cette raison que le TBS "existe" Quand je n'ai aucune restriction, j'utilise indifferement les deux avec ou sans tween.
A+
merci des precisions Gorben
Bonsoir Dieu_x,
en fait je voulais plus connaitre le type d'anticorps et les modes de révélation.
Ceci dit j'ai quand même cherché dans ma doc car j'avais le vague souvenir d'avoir participé à un séminaire consacré à l'immunohistochimie. Où un grand Professeur nous avait parlé des petits secrets de paillasse pour réussir son immuno. Il nous a beaucoup parlé des tampons alors pourquoi pas vous faire profiter d'une partie de ce qu'il nous a raconté.
Tout d'abord à quoi cela sert d'avoir des tampons salins: Pour éviter l'agrégations des protéines et des anticorps sous l'effet des forces électrostatiques. Les ions de petites tailles viennent former un écran autour des protéines chargées. En cas de bruit de fond on peut augmenter la force ionique de la solution en poussant la concentration de NaCl jusqu'a 0,5M.
Maintenant quand utilise t'on le PBS? Tout le temps, (surtout en utilisant de Ac monoclonaux ou le TBS est moins bon) sauf quand on veut révéler un anticorps marqué à la phosphatase alcaline (car le PBS apporte une grande quantité de phosphate inorganique).
On utilise donc le TBS préférentiellement avec ce mode de révélation.
Pour les additifs type lait et tween:
Le lait écrémé agit par compétition pour les sites d'accrochage non spécifique. Chez nous au labo on utilise plus facilement de l'albumine bovine.
Le Tween, c'est un surfactant (comme le Triton X100 et le Chaps) qui a quatre rôles principaux en IHC.
-limiter le bruit de fond lié au interactions hydrophobes entre tissus et anticorps.
-améliorer la mouillabilité de la coupe par réduction des tension de surface.
-stabiliser les anticorps et protéines enzymatiques et limiter leurs agrégations.
-perméabiliser les tissus.
Il a particulièrement insisté sur le fait que les surfactant n'étaient pas trés stable et que les produits de dégradation peuvent dénaturer le protéines. Il fut donc les acheter par petites quantité afin d'éviter les soucis. Pour lui c'est la principale cause de problème sporadique en IHC
Voila c'est tout pour plus d'infos je peut scanner mon résumer de séminaire, mais bon c'est une association à laquel j'adhere qui l'organise tous les ans alors ca me géne un peu...
A+
Fifikz
nan nan c'est bon ne t'embete pas...c'est largement suffisant
mercii beaucoup à tous
Mais alors, quelle est dès lors la différence entre l'utilisation du TBS et du PBS-T. Car je croyais justement que le tween en déstabilisant les liaisons faible allait donc "casser" les liaisons aspécifiques.
autre petite question : est que vous savez pourquoi le tampon de blocage contenait du Triton (solvant dont je connais le role) pour l'ICC et pas pour le western ?
merci encore
