Tester la force d'un promoteur

[invite17a570c1]

Bonjour,

J'ai une question. On nous dit souvent que tel promoteur est fort, tel autre faible. Comment a-t-on procédé pour connaître la force d'un promoteur?

Merci

Cordialement,
-----

[invitea0443c8c]

Salut!
En placant un même gène (comme la luciférase) derrière plusieurs promoteurs différents, tu peux les comparer et voir lequel permet la plus forte expression en dosant en gène en aval.

V.

[invitec9f0f895]

Vinc a raison, sinon en faisant des northern blot (ou des PCR en temps reel) et en comparant a un gene de reference.

Yoyo

[invite17a570c1]

Oki doki. J'avais pensé à lacZ aussi, non?

Merci
Cordialement,

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee863e61a]

Oki doki. J'avais pensé à lacZ aussi, non?

Merci
Cordialement,

Ou un autre gène rapporteur du même genre

On peut avoir une idée préalable de la force d'un promoteur en fonction des bases conservées par rapport au consensus.

[invitec9f0f895]

Oki doki. J'avais pensé à lacZ aussi, non?

Merci
Cordialement,

Oui tout a fait, lacz, gfp rfp, Rluc, fluc, luc2 etc...le principe est toujours le meme. Historiquement cela a été fait avec lacZ.

Yoyo

[invite17a570c1]

D'accord. Ma question portait plutôt là-dessus justement, étant donné que la PCR n'existe pas depuis si longtemps que ça et que le système luciférase a été découvert plus tardivement que lacZ...

Cordialement,

[invitec9f0f895]

D'accord. Ma question portait plutôt là-dessus justement, étant donné que la PCR n'existe pas depuis si longtemps que ça et que le système luciférase a été découvert plus tardivement que lacZ...

Cordialement,

Et avant lacZ c'etait des northern blot systématiquement.

Yoyo

[piwi]

Pour y ajouter ma petite couche, personnellement j'utilise la CAT. Historiquement c'était plus lourd à faire que la luciférase ou le lacZ mais maintenant il existe des kit très simple. C'est intéressant parce que la méthode est très sensible.

Piwi

[invitee863e61a]

Pour y ajouter ma petite couche, personnellement j'utilise la CAT. Historiquement c'était plus lourd à faire que la luciférase ou le lacZ mais maintenant il existe des kit très simple. C'est intéressant parce que la méthode est très sensible.

Piwi

Il y a deux façons de tester l'activité CAT:

- doser le pourcentage de chloramphénicol acétylé (le Cm est marqué et migre différement selon qu'il est acétylé ou pas). Il parait que cette technique est laborieuse
- Test de résistance au Cm

[invite17a570c1]

Je ne connais pas du tout ce test CAT.
Comment on évalue la force d'un promoteur selon la résistance à un antibio?

Cordialement,

[piwi]

Moi j'ai un kit ELISA CAT avec des anticorps anti CAT, c'est ridiculement simple. Long mais simple. C'est vrai que ça n'est pas réellement un essai CAT lourdingue.

[invitee863e61a]

Je ne connais pas du tout ce test CAT.
Comment on évalue la force d'un promoteur selon la résistance à un antibio?

Cordialement,

En faisant des CMI, c'est à dire en regardant quel est la plus petite concentration d'un antibiotique pour laquelle il n'y a pas de croissance bactérienne (ca se fait à l'oeil nu, donc un peu subsjectif).

[invite17a570c1]

Comment est exprimée la corrélation directe entre la CMI et la force du promoteur?
Je comprends ce que tu dis, c'est intuitif. Mais si l'on parle "scientifique", c'est comment?

Cordialement,

[invitee863e61a]

Comment est exprimée la corrélation directe entre la CMI et la force du promoteur?
Je comprends ce que tu dis, c'est intuitif. Mais si l'on parle "scientifique", c'est comment?

Cordialement,

Si l'on veut pouvoir comparer un promoteur à un autre, il faut bien sûr maitriser le contexte génétique, à savoir la RBS, le nombre de copies du gène, la souche dans laquelle tu travailles, etc.
Plus un promoteur est fort, plus le nombre d'enzymes codant le gène de résistance est important et la CMI sera élevée. La CMI est une information qui intéresse généralement les biologistes (jusqu'à quel dose d'antibio est résistante ma souche? etc) et son amplitude de variabilité dépend du mode d'action du produit du gène (pompe à efflux? inactivation de l'antibio? etc.)

[invitef047ccfa]

on a nous fait lire une publication en cours qui porte sur l'utilisation des genes rapporteurs. Les auteurs testaient la fiabilité du gene rapporteur LUC dans des situations où on a des régulations avec de l'APMc. Ils conlcuaient sur le fait que LUC ne traduisait pas directement la régulation transcriptionnelle des genes induite par un traitement quelquonque. Il y avait en fait un biais : les auteurs pensent que LUC interfere ("artificielement") avec l'AMPc....ce qui modifie la fluorescence et ne rend donc pas compte de la régulation réelle des genes.

Est ce que vous avez entendu parler de cet article ? est ce qu'il a changé vos facons de travailler ?

"evaluation of the use of luciferase reporter gene system for gene regulation studies involving AMPC elevating agents" 1995, Omar BENZAKOUR and coll

[gorben]

Si l'on veut pouvoir comparer un promoteur à un autre, il faut bien sûr maitriser le contexte génétique, à savoir la RBS, le nombre de copies du gène, la souche dans laquelle tu travailles, etc.
Plus un promoteur est fort, plus le nombre d'enzymes codant le gène de résistance est important et la CMI sera élevée. La CMI est une information qui intéresse généralement les biologistes (jusqu'à quel dose d'antibio est résistante ma souche? etc) et son amplitude de variabilité dépend du mode d'action du produit du gène (pompe à efflux? inactivation de l'antibio? etc.)

Salut,

Ouais enfin doser l'activite d'un promoteur via une difference de CMI, faut vraiment pas vouloir etre precis ! Il est tres nettement plus precis de doser láctivite enzymatique, et pas le phenotype. De plus determiner la CMI d'une souche est une manip assez lourde, en tout cas bien plus que lacZ, Luc ou un autre du meme style et pas vraiment plus legere que la determination de l'activite CAT.

A+

[invitee863e61a]

Salut,

Ouais enfin doser l'activite d'un promoteur via une difference de CMI, faut vraiment pas vouloir etre precis ! Il est tres nettement plus precis de doser láctivite enzymatique, et pas le phenotype. De plus determiner la CMI d'une souche est une manip assez lourde, en tout cas bien plus que lacZ, Luc ou un autre du meme style et pas vraiment plus legere que la determination de l'activite CAT.

A+

Je suis d'accord, mais je ne trouve pas la manip très lourde. La CMI en recherche fondamentale n'a que très rarement un intérêt.