Bonjour,
Je m'interroge quant à savoir la technique qui pourrait être employée afin d'insérer un promoteur viral afin de permettre l'expression d'un gène de résistance dans une cellule eucaryote. Il est clair que sa présence est indispensable, mais comment l'isoler et l'ajouter (sites de restriction?) ?
Voilà, je vous remercie de votre aide!
Par PCR :
Sur ton insert, tu fais une PCR en utilisant 2 amorces hybridant aux extrémités de ton DNA. Pour l'amorce hybridant en 5', tu ajoutes en 5' de celle-ci la séquence de ton promoteur viral (je suppose que tu utilises un promoteur viral d'eucaryote, CMV par exemple), et le tour est joué. Si ça avait été dans une bactérie, tout aurait été plus compliqué car t'aurais dû ajouter le RBS pile dans le bon cadre de lecture.
Et est-ce que tu sais ce que tu vas mettre en 3' de ta séquence?
A désolé j'avais pas vu que tu demandait aussi comment l'isoler. Bein les séquences de ce types de promoteur sont archi connues donc quand tu commandes tes amorces, tu peux leur demander qu'ils te rajoutent ta séquence promotrice en amont de ton amorce 5' et le tour est joué.
Salut!
Il y a beaucoup plus simple! Tu choisis un plamside qui possède déjà le promoteur : les catalogues des fournisseurs sont remplis de plasmides avec le promoteur de ton choix, le gène de résistance, les terminateurs, etc..... Toutes les combinaisons sont possibles! Tu n'as qu'à cloner ta séquence dans le plasmide!
Une amorce PCR est relativement courte et ne peut pas comprendre la séquence complète de tous les promoteurs.
A+
Vinc
Re : Insertion d'un promoteur sur un vecteur plasmidique
Il me semble que Vlper demandait comment mettre un promoteur viral sur un plasmide, et non pas comment s'approprier un plasmide avec le promoteur viral tout prêt.............ça peut être bien parfois de ne pas passer par la facilité des catalogues et réfléchir un peu à "comment c'est fait", non?
Et puis la PCR pour mettre un promoteur, cela me semble tout à fait convenable. Un promoteur minimal fait combien à peu près, dans les 50 bases au max. Admettons qu'on prenne une séquence en 5' de 50 bases qui s'hybride à notre fragment, cela est suffisant pour avoir une hybridation spécifique, et notre amorce fait donc 100 bases. Ca c'est déjà vu de telles amorces pour des expériences de RACE (Rapid Amplification of cDNA End)..................
Voili voilou!
Tu permets que je donne mon avis????.........Merci!Envoyé par synchrotron
Je t'explique simplement comment on procéderait en recherche, et si dire "tu prends la séquence du promoteur et tu la colles dans le plasmide" te demande de la réflexion à un point tel que ça en devient intéressant pour toi, alors je ne sais plus quoi dire!
Les exercices de premiers et seconds cycles sont parfois bien éloignés de la réalité de la recherche, or ici Vlper se posait une question pratique, se demandait comment on s'y prendrait dans labo de recherche : moi je prend un plasmide qui a le promoteur voulu et je le modifie... point final!
Tu conviendras que pour un clonage de base les primers font entre 18 et 22 nt environ et pas 150....
Vinc
