augmentation du taux d'ARN mais non celui de la protéine
bonsoir
quand effectue une stimulation à l'aide d'un ligand qui induit une augmentation du taux d'ARN d'un gène cible alors que la protéine est non détectée en western-blot, qu'est ce que vous en pensez? qu'est ce vous proposer comme expériences (stabilité ARN...) pour expliquer tout ça?
Rq: un témoin positif est réalisé et dans lequel on détecte la présence de la protéine!!
j'attends vos suggestions!
merci à tous pour votre aide!
bonne soirée
salut
L'hypothese la plus simple est qu'il y a une regulation traductionnelle de ton gene. L'autre possibilité est que tu es a faire à un ARN non codant
YOyo
cet ARN est codant!
merci de ton aide!
Envoyé par sarra672
Le taux de transcrit ne permet pas une traduction suffisante. Ou alors c'est un problème de différence de sensibilité de tes manips (dosage très sensible pour les transcrits, western peu efficace)
Tu connais la localisation de la protéine?
Le ligand que tu ajoutes, c'est le ligand de la protéine? comment agit il sur le taux de transcription de ton gene?
Cherche des signaux de regulation dans le 5' et/ou le 3' UTR
YOyo
le gène considéré code pour une phosphoprotéine nucléaire.
je ne pense pas que ce soit une sensibilité des WB puisque le témoin positif est là pour contredire cette hypothèse sachant même qu'en taux d'ARN ce témoin positif stimule de manière moins efficace que le ligand.
vous avez d'autres suggestions?
le ligand agit de manière indirecte sur le taux d'ARN du gène cible. ce n'est pas un ligand directe!
L'ARN subit peut etre un mecanisme de dégradation avant d'etre traduit (ARN interferent...) ?
Les AC utilisés en western sont bien spécifiques ? Le ligand induit il bien le gene ?
bjr
le ligand augmente le taux d'ARN du gène cible par rapport au témoin
l'immunocytochimie semble confirmer ce résultat au niveau protéique mais en WB rien!
un siRNA de ce gène me semble nécessaire pour déterminer la présence de la protéine si on constate une diminution du taux d'ARN d'un autre gène sous le contrôle du premier gène cible.
qu'est-ce que vous en pensez?
en tout cas merci !
Tu mets combien de µg ou mg de protéines dans ton western? Combien de témoin positif?
Ce temoin positif est ce de la protéine purifiée?
Parce que je ne comprends pas l'hypothèse de la dégradation si l'IHC marche.
Ta protéine est une protéine nucléaire? Est tu certaine de bien libérer toutes les protéines dans ton extrait protéique? En particulier vas tu assez loin dans la concentration en KCl? Si cela se trouve ta protéine reste fixée sur l'ADN.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
As tu pensé que ta protèÏne était peut-être couplée à une une autre protéïne ou à un inhibiteur au niveau du site de reconnaissance par l'anticorps. La simplicité est souvent la bonne explication, par contre il serait étonnant que ton IHC marche....
bjr
j'utilise 30 mg de protéines.
un témoin positif correspondant à un trairtement 20% sérum
c'est un lysat de protéines totales et non purifié, pensez vous que je dois faire une immunoprécipitation?
oui c'est une protéine nucléaire mais je ne crois pas qu'elle ne puisse pas etre récupérée da,s le lysat alors que le témoin positif montre sa présence.
les conditions sont dénaturantes pour penser à une liaison avec une autre protéine!
je ne sais pas ça prend la tête quand même!
Où je m'interroge
Là où je suis vraiment perturbé c'est que j'ai un peu le même problème que toi avec une protéine. Les Ig fonctionnent en IHC mais pas en western. En revanche ça fonctionne en dot-blot (non dénaturant donc) ou en IP. Du coup pour moi c'est vraiment la dénaturation du western qui pose problème.
Toi en revanche tu as un témoin positif.
Je suis désolé mais il y a un truc que je n'ai toujours pas compris.
Le lysat c'est ton extrait expérimental ou ton contrôle. Parce que si c'est ton extrait expérimental elle n'est peut être simplement pas assez concentrée dans ton extrait. Du coup dans ce cas là, le plus simple dans un premier temps serait de faire un extrait nucléaire et un passage en centricon/microcon (rien de vulgaire) pour concentrer ton matériel et en mettre 3 caisses.
Si c'est ton contrôle là je sèche un peu parce que ça voudrait dire qu'il y a une tonne de tes prot dans tes cellules et qu'en plus elles ne sont pas intimement liées à l'ADN. Aucune raison de se louper.
Où j'essaie de comprendre.
Tu as une expérience avec un traitement X et un contrôle avec du sérum.
Quand tu fais tes IHC tu vois la protéine dans les contrôles et dans les expérimentaux au même taux? Tu as fais l'expérience de l'IHC sans sérum pour vérifier que ton contrôle est bien neutre évidemment.
Tu fais des extraits archi basiques et là mystère, ca répond dans le contrôle mais plus dans l'expérimental.
C'est bien cela l'ensemble du problème?
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Où je m'interroge
Là où je suis vraiment perturbé c'est que j'ai un peu le même problème que toi avec une protéine. Les Ig fonctionnent en IHC mais pas en western. En revanche ça fonctionne en dot-blot (non dénaturant donc) ou en IP. Du coup pour moi c'est vraiment la dénaturation du western qui pose problème.
Toi en revanche tu as un témoin positif.
Je suis désolé mais il y a un truc que je n'ai toujours pas compris.
Le lysat c'est ton extrait expérimental ou ton contrôle. Parce que si c'est ton extrait expérimental elle n'est peut être simplement pas assez concentrée dans ton extrait. Du coup dans ce cas là, le plus simple dans un premier temps serait de faire un extrait nucléaire et un passage en centricon/microcon (rien de vulgaire) pour concentrer ton matériel et en mettre 3 caisses.
Si c'est ton contrôle là je sèche un peu parce que ça voudrait dire qu'il y a une tonne de tes prot dans tes cellules et qu'en plus elles ne sont pas intimement liées à l'ADN. Aucune raison de se louper.
Où j'essaie de comprendre.
Tu as une expérience avec un traitement X et un contrôle avec du sérum.
Quand tu fais tes IHC tu vois la protéine dans les contrôles et dans les expérimentaux au même taux? Tu as fais l'expérience de l'IHC sans sérum pour vérifier que ton contrôle est bien neutre évidemment.
Tu fais des extraits archi basiques et là mystère, ca répond dans le contrôle mais plus dans l'expérimental.
C'est bien cela l'ensemble du problème?
Cordialement,
piwi
t'as bien compris l'ensemble du pb!j'effectue plusieurs traitements sur mes cellules qui induisent une augmentation du taux d'ARNm d'un gène cible. j'effectue un témoin positif avec 20% SVF (augmentation) et un témoin négatif sans traitement (pas d'augmentation).
je m'attends donc à avoir une augmentation d'expression de ma protéine dans les échantillons traités et dans le témoin 20% SVF et rien dans témoin négatif.
ce que je constate c'est une augmentation de ma protéine que dans le témoin positif et non dans les traités. sachant que l'induction de l'ARNm du 20% SVF est moins importante que dans les traitements.
en immunocyto ça marche mais comme ce n'est pas une réponse du tout au rien...
les extraits en WB sont des extarits de protéines totales pour chacun des traitements, pour le témoin positif et négatif. en WB je vois une grosse bande en 20% svf et rien dans les traitement.
c'est ça l'ensemble du pb!
merci de vous te creuser la tête
J'ai eu un problème avec une protéïne où l'IHC marchait alors que le WB et le Dot ne fonctionnaient pas, la réponse fut qu'en changeant d'Ac secondaire ça marchait. Je ne sais pas pourquoi mais le revendeur m'a dit "ça arrive". Essaie peut-être en empruntant un Ac II différent du tien.
Sinon tu es sûr que ton traitement augmente bien ce gène et que ton IHC n'est pas un faux positif?
bjr
en tout cas au niveau ARN c'est le cas, pour la protéine je ne suis pas si sur...c'est bien ça le souci!
Je ne l'ai jamais fais donc je ne sais pas si ca fonctionne bien mais une astuce pour faire le tri serait d'utiliser un ARNi/morpholino antisens à ton ARNm pour faire un IHC sur tes cellules "mutantes" pour ta protéine. Le contrôle d'inhibition de l'expression de l'ARN endogène serait un northern ou une qPCR.
Bon ça reste un peu théorique mais je crois qu'a un moment il faut aussi se demander si ce que tu observes en IHC est bien réel ou si c'est un artéfact. Et là y a pas 36 solutions autres que d'étudier des cellules sans protéine.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
c'est exactement ce que je pense faire mais ça va tout de même attendre quelques temps!c'est prévu mais à la base c t pour autre chose mais mnt ça sera pour ça aussi
cordialement
sarra
Bonsoir,
Si je comprends bien : tu ajoutes ton ligand et tu voies le taux de votre ARN augmenter alors qu'il n'y a plus de protéine.
J'ai plein de questions.
Qu'appeles-tu taux d'ARN ? C'est le taux de synthèse ? (donc tu as mesuré l'activité transcriptionnelle de ton gène). C'est la présence de l'ARNm à l'équilibre ? En gros, tu as fait un northern ou une qPCR (et dans ce cas, il faut prendre en compte la stabilité du messager - quel impact de la fixation du ligand sur la demi-vie de l'ARNm ?). Je pense qu'il est important pour toi de définir l'effet du ligand sur l'expression et la stabilité du messager.
Maintenant, je te l'accorde, ces questions ne concernent pas le "soucis" de la détection de la protéine. Sachant que la protéine est détectée en WB dans le contrôle positif et négatif, ce n'est pas un soucis de détection.
Alors....
Quel est l'effet phénotypique de ton ligand ? Je veux dire par la, obtiens-tu le meme effet pour les cellules que dans le contrôle positif ?
Ce que je sous-entends c'est : peut etre que ton ligand induit une augmentation de la quantité du messager (en jouant sur sa synthèse ou sa stabilité (voir premier point) mais également une dégradation rapide de la protéine ce qui fait que tu ne peux plus la détecter. As-tu tenté de bloquer le protéasome.
PS : j'ai pas compris l'interet du RNAi....
je rejoints la précédente réponse : le controle positif se fait à 20% SVF. Dans ce cas, tu actives un max de kinases, ce qui se traduit entre autre par la phosphorylation de facteurs nucléaires, leur relocalisation dans certains cas. Est ce le cas de ta protéine ? Peut on imaginer qu'une phosphorylation puisse jouer sur sa stabilité , que cette phosphorylation ait lieu en présence de sérum, mais pas de ligand ?
Le phénomène se reproduit il dans une autre lignée ? Que se passe t il lors de la transfection avec un vecteur d'expression pour cette protéine ?
Sinon pour la RT PCR, as tu ciblé différentes parties du mRNA,car il se peut que la transcription soit augmentée, mais que l'ARN soit dégradé/instable.
Wouahouuu...
Je pense quand même que vous envisagez de sortir l'artillerie lourde un peu tôt.
Avant de s'embarquer vers des analyses d'effet du ligand sur la stabilité des messagers j'aurais quand même tendance à essayer de confirmer mes résultats paradoxaux.
L'idée de l'ARNi ou du morpholino est justement là. C'est de voir si ce que détecte son anticorps est bien spécifique.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Encore une verification rapide : les amorces amplifient elles bien l'ARN messager maturé (amplification autour d'une jonction exon/exon) ?
En plus du RNAi je ferais aussi une surexpression de la protéine pour vraiment caractériser les anticorps.
Vu la difficulté de mettre au point du siRNA efficace, ca me semble bien lourd juste pour vérifier.
YOyo
bein justement, l'artillerie lourde ce sont les morpholino ou autres siRNA. Regarder le taux de synthèse et la stabilité du messager, c'est pas violent en comparaison.
D'autant qu'elle sait déjà que son anticorps est spécifique avec les controle positifs et négatifs qui fonctionnent. Pour moi le "soucis" ne vient pas de l'anticorps.
Par rapport au paradoxe des résultats, ce ne serait pas la premiere fois qu'un ligand active la dégradation d'un messager ou de sa protéine alors que l'on note une légère augmentation de la trancription. En fait, concernant l'ARNm tout réside dans ce qu'elle appelle "taux d'ARN" (voir mon post précédent).
C'est pour cela que je regarderai l'effet sur l'ARNm (stabilité et synthèse).
Sinon, comme je l'écrivais, l'autre possibilité est que son ligand envoie sa proteine vers une dégradation. Traiter les cellules avec un inhibiteur du protéasome, c'est super rapide et c'est bien plus facile a mettre en place que des siRNA.
Sauf que la clé du problème est là:
C'est pas juste une dissociation entre la transcription/stabilité de l'ARNm et la synthèse/stabilité des protéines. C'est qu'il y a deux résultats non concordants.le ligand augmente le taux d'ARN du gène cible par rapport au témoin
l'immunocytochimie semble confirmer ce résultat au niveau protéique mais en WB rien!
Je maintiens qu'il doit y en avoir un des deux qui foire quelque part. Si vous enleviez l'IHC on serait ok. Mais le problème c'est qu'elle est là. L'honneté oblige d'en tenir compte. Du coup la question qui se pose est: est ce que ce qu'elle observe en IHC n'est pas un artéfact? La seule solution que je connaisse pour tester un anticorps c'est de faire la manip' sur une cellule/tissu n'exprimant pas la protéine cible. Ca ne serait pas le premier anticorps foireux qui circule.
Alors après, je précisais bien que ma suggession de morpholino/ARNi était théorique vu que je ne l'ai jamais fais (je bosse sur des souris KO, c'est la génétique qui m'apporte mes contrôles; et vous n'avez peutêtre pas idée de la quantité d'anticorps faux positifs qui circulent....)
Quoi qu'il en soit si je considère le processus de réflexion, il faut réussir à trier le bon grain de l'ivrais avant d'aller plus loin et se lancer dans des manip' donnant une explication causale à une partie des observations.
Cordialement,
piwi
PS: dans mon labo (pas dans mon equipe) il y a des gens qui travaillent avec des morpholinos ou des ARNi et ils n'ont pas l'air terrorisés par cela. M'enfin, vu de loin ca n'a pas l'air d'être un cauchemard. Je me trompe peut être...
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Bonjour tout le monde.
Je viens de parcourir le topic rapidement. Au vu des différentes réactions que tu as (taux d'ARN augmenté, IHC OK et WB rien), ilo me semble que cela vienne de la dénaturation de ta protéine en WB. Ton anticorps primaire est-il un anticorps dirigé contre la séquence de ta protéine d'intérêt ou un anticorps séquentiel?
Avant de faire des trucs très lourds à mettre en place comme les morpholinos/ARNi, ne pourrais tu pas changer d'anticorps primaire et voir les résultats obtenus?
Si tu ne sais pas si ton anticorps est séquentiel ou conformationnel, appelles le commercial qui te l'a vendu ou la personne qui t'a fourni cet anticorps.
En espérant avoir pu t'aider.
peptide63
