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Protocole digestion




  1. #1
    MaliciaR

    Protocole digestion

    Bonjour,

    J'ai rien à faire ce soir puisque toutes mes PCR réussissent alors je préparais mon protocole de digestion pour demain.
    Une question : quelle quantité d'ADN plasmidique devrais-je mettre? Mon plasmide a une concentration de 150 ng/ul, j'ai fait mon calcul pour le nombre d'unités d'enzyme pour 1 ug d'ADN plasmidique. Est-ce une quantité cohérente (mon clonage ultérieur sera un peu ch****)?

    Merci

    Cordialement,

    -----

    An expert is one who knows more and more about less and less.

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  3. #2
    jmbowie

    Re : Protocole digestion

    Citation Envoyé par MaliciaR Voir le message
    Bonjour,

    J'ai rien à faire ce soir puisque toutes mes PCR réussissent alors je préparais mon protocole de digestion pour demain.
    Une question : quelle quantité d'ADN plasmidique devrais-je mettre? Mon plasmide a une concentration de 150 ng/ul, j'ai fait mon calcul pour le nombre d'unités d'enzyme pour 1 ug d'ADN plasmidique. Est-ce une quantité cohérente (mon clonage ultérieur sera un peu ch****)?

    Merci

    Cordialement,
    Si tu mets 1 unité d'enzyme et que la réaction fonctionne à 100%, tu auras 1microgramme de digéré. Je te conseille de mettre plutôt 2 unités avec 10 microlitres de ton plasmides (1,5mg), tu devrais avoir largement assez de matériel pour le clonage qui suit. Bien sûr, cela dépend de la taille de ton produit de PCR, des sites de clonages, si tu as orienté, de l'efficacité a priori de ta ligation, etc.
    On peut en parler plus précisement si tu veux
    Blast up your life!

  4. #3
    MaliciaR

    Re : Protocole digestion

    En fait, le truc est que j'ai calculé la quantité d'enzyme et je mets 4 fois plus histoire de ne pas louper les sites
    Mais pas très envie de bafouiller sur mon tube de plasmide, c'est tout ce que j'aurai donc je ne veux pas en gaspiller.
    Le clonage que je dois faire est un peu spécial : il est orienté, mais à moitié. Je m'explique : l'un de mes enzymes est BamHI, l'autre NcoI. Le souci est que j'ai un site NcoI au milieu de l'insert, du coup j'ai fait des PCR de demi-insert
    Je vais donc faire une digestion en 2 lots : l'un avec NcoI, l'autre avec BamHI. Après le gel, j'inverse les lots et les digère avec l'autre enzyme. Enfin, clonage : je vais commencer par cloner le bout Cter contenant le site BamHI, puis je clonerai le Nter entouré par les deux extrémités NcoI. Je suis en train de fouiller pour deux enzymes à sites uniques asymétriques pour vérifier l'orientation de l'insert à la fin.
    Je pense que ça de bio mol me suffira pour toute l'année

    Je me demandais si cette quantité de plasmide est donc suffisante pour ce que je veux faire (c'est la toute première fois que je fais un protocole de digestion )

    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.


  5. #4
    jmbowie

    Re : Protocole digestion

    Citation Envoyé par MaliciaR Voir le message
    En fait, le truc est que j'ai calculé la quantité d'enzyme et je mets 4 fois plus histoire de ne pas louper les sites
    Mais pas très envie de bafouiller sur mon tube de plasmide, c'est tout ce que j'aurai donc je ne veux pas en gaspiller.
    Le clonage que je dois faire est un peu spécial : il est orienté, mais à moitié. Je m'explique : l'un de mes enzymes est BamHI, l'autre NcoI. Le souci est que j'ai un site NcoI au milieu de l'insert, du coup j'ai fait des PCR de demi-insert
    Je vais donc faire une digestion en 2 lots : l'un avec NcoI, l'autre avec BamHI. Après le gel, j'inverse les lots et les digère avec l'autre enzyme. Enfin, clonage : je vais commencer par cloner le bout Cter contenant le site BamHI, puis je clonerai le Nter entouré par les deux extrémités NcoI. Je suis en train de fouiller pour deux enzymes à sites uniques asymétriques pour vérifier l'orientation de l'insert à la fin.
    Je pense que ça de bio mol me suffira pour toute l'année

    Je me demandais si cette quantité de plasmide est donc suffisante pour ce que je veux faire (c'est la toute première fois que je fais un protocole de digestion )

    Cordialement,
    Meuh oui, largement, surtout que ces enzymes sont courantes et coupent très bien.
    Blast up your life!

  6. #5
    MaliciaR

    Re : Protocole digestion

    Cool Merci

    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    piwi

    Re : Protocole digestion

    Une stratégie PCR pour screener tes clones. Tu vas avoir deux orientations possibles. Si tu designes une paire d'amorce comme celle que je t'indique tu devrais trouver tes clones.

    -->--------------1-----------2
    BamHI----------NcoI--------NcoI
    --------------------------<--

    ou

    -->--------------2-----------1
    BamHI----------NcoI--------NcoI
    --------------------------------->


    Avant ton clonage je ne peux que t'inviter à purifier plasmides et fragments PCR.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  9. #7
    jmbowie

    Re : Protocole digestion

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Une stratégie PCR pour screener tes clones. Tu vas avoir deux orientations possibles. Si tu designes une paire d'amorce comme celle que je t'indique tu devrais trouver tes clones.

    -->--------------1-----------2
    BamHI----------NcoI--------NcoI
    --------------------------<--

    ou

    -->--------------2-----------1
    BamHI----------NcoI--------NcoI
    --------------------------------->


    Avant ton clonage je ne peux que t'inviter à purifier plasmides et fragments PCR.

    Cordialement,
    piwi
    Pour cribler les clones qui sont dans le bons sens, je prendrai en sus une amorce dans le vecteur (en aval): 2 bandes = insert dans le bon sens, 1 bande= insert dans le mauvais sens, pas de bande pas d'insert
    Cela permet de vérifier que tu es dans le bon vecteur, que ton produit est entier et au bon site (on sait jamais!)
    Blast up your life!

  10. Publicité
  11. #8
    MaliciaR

    Re : Protocole digestion

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Une stratégie PCR pour screener tes clones. Tu vas avoir deux orientations possibles. Si tu designes une paire d'amorce comme celle que je t'indique tu devrais trouver tes clones.

    -->--------------1-----------2
    BamHI----------NcoI--------NcoI
    --------------------------<--

    ou

    -->--------------2-----------1
    BamHI----------NcoI--------NcoI
    --------------------------------->
    Merci, Piwi! Mais c'est mieux qu'une digestion par deux enzymes de restriction (comme je le pensais)?

    Avant ton clonage je ne peux que t'inviter à purifier plasmides et fragments PCR.
    Ouaip, je fais la purif' demain après-midi, avant le clonage

    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  12. #9
    jmbowie

    Re : Protocole digestion

    L'avantage de la PCR, c'est que tu peux la faire directement sur les clones, sans passer par une étape d'extraction d'ADN. De plus, mais cela dépend de la taille de ton insert, s'il est petit tu peux galérer pour avoir digérer assez d'ADN et le voir (insert de 150 pbs, faut digérer énormément de plasmides pour le voir)
    Blast up your life!

  13. #10
    piwi

    Re : Protocole digestion

    Ben disons que la restriction ca peut prendre la tête, les enzymes qui ne coupent pas, les enzymes qui ne sont pas compatibles, faire du séquentiel. La chiotte quoi.
    La tu designes deux oligos (si tu ne les a pas déjà, mais à priori tu les as non?) et hop une PCR avec un hot start de 10-15 mins sur tes colonies, une 1,5h plus tard t'as fini ton screen et tu ne t'aies pas pris la tête.

    Moi c'est comme ça que je fais quand je suis dans ton cas.
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  14. #11
    jmbowie

    Re : Protocole digestion

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Ben disons que la restriction ca peut prendre la tête, les enzymes qui ne coupent pas, les enzymes qui ne sont pas compatibles, faire du séquentiel. La chiotte quoi.
    La tu designes deux oligos (si tu ne les a pas déjà, mais à priori tu les as non?) et hop une PCR avec un hot start de 10-15 mins sur tes colonies, une 1,5h plus tard t'as fini ton screen et tu ne t'aies pas pris la tête.

    Moi c'est comme ça que je fais quand je suis dans ton cas.
    Idem, et sur colonies directement
    Blast up your life!

  15. #12
    MaliciaR

    Re : Protocole digestion

    Citation Envoyé par jmbowie Voir le message
    s'il est petit tu peux galérer pour avoir digérer assez d'ADN et le voir (insert de 150 pbs, faut digérer énormément de plasmides pour le voir)
    Il fait 2500 pb pratiquement, donc pas de soucis de ce côté

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Ben disons que la restriction ca peut prendre la tête, les enzymes qui ne coupent pas, les enzymes qui ne sont pas compatibles, faire du séquentiel. La chiotte quoi.
    La tu designes deux oligos (si tu ne les a pas déjà, mais à priori tu les as non?) et hop une PCR avec un hot start de 10-15 mins sur tes colonies, une 1,5h plus tard t'as fini ton screen et tu ne t'aies pas pris la tête.

    Moi c'est comme ça que je fais quand je suis dans ton cas.
    Je comprends l'avantage de la PCR maintenant, oui Je vais faire les oligos demain matin. J'ai fait la stratégie de clonage toute seule, ma chef est un peu trop occupée à faire le projet ANR (à rendre avant demain 12h ). Du coup, pour les trucs simples, j'ai fait toute seule, avec les connaissances que j'ai de la fac Et puis, SIGMA pètent les c*******, ils mettent 3 plombes à envoyer les oligos!

    Merci beaucoup pour les éclaircissements

    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  16. #13
    jmbowie

    Re : Protocole digestion

    Ma chef a terminé le truc ANR hier

    Pour les trucs même simples, n'hésite pas

    Sigma met 2j en principe, c'est plus casse-c*** quand dans la commande, y'en a un qui a mis des trucs marqués ou une purif HPLC
    Blast up your life!

  17. #14
    piwi

    Re : Protocole digestion

    Chez nous sigma met deux trois jours ouvrables à envoyer des oligos 20 mer non purifiés HPLC (inutile pour de la PCR simple).
    Franchement je ne trouve pas ça long moi!
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  18. #15
    MaliciaR

    Re : Protocole digestion

    Beh, j'ai reçu les oligos commandés mardi dernier hier! Le comble était qu'ils en avaient oublié un et que j'ai fait ma dernière PCR aujourd'hui après l'avoir reçu...!
    Je ne porte pas la poisse
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  19. #16
    piwi

    Re : Protocole digestion

    Ca ne m'est jamais arrivé qu'ils en oublient. Ca c'est vraiment pas de bol!
    Il m'est arrivé d'avoir quelques réceptions différées mais ça reste exceptionnel.

    Tu peux faire des restrictions mais tu vas être obligée de faire tes miniprep sur plusieurs clones, c'est long et chiant. Moi je préfere attendre les oligos et faire autre chose de ma matinée qu'une cinquantaine de miniprep
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  20. #17
    MaliciaR

    Re : Protocole digestion

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Ca ne m'est jamais arrivé qu'ils en oublient. Ca c'est vraiment pas de bol!
    Il m'est arrivé d'avoir quelques réceptions différées mais ça reste exceptionnel.
    J'ai l'habitude... Il m'arrive régulièrement des trucs dont les gens sortent : "Mais c'est exceptionnel" ou "Mais ça n'arrive jamais!"...

    Tu peux faire des restrictions mais tu vas être obligée de faire tes miniprep sur plusieurs clones, c'est long et chiant. Moi je préfere attendre les oligos et faire autre chose de ma matinée qu'une cinquantaine de miniprep
    Non, je crois qu'attendre SIGMA est plus plaisant Parce que la miniprep m'emmerde profondément

    Merci encore une fois pour les conseils
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  21. #18
    jmbowie

    Re : Protocole digestion

    Si tu veux juste faire une digestion, tu peux faire du "boiling" pour extraire l'ADN: en gros, tu resuspends ta colonie dans de l'eau chaude, tu mélanges et tu digères
    Blast up your life!

  22. #19
    piwi

    Re : Protocole digestion

    Ca marche bien ça? Ils doivent pas être terribles les profils de digestions non?
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  23. #20
    jmbowie

    Re : Protocole digestion

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Ca marche bien ça? Ils doivent pas être terribles les profils de digestions non?
    Un collègue l'a beaucoup utilisé et c'est pas trop mal,mais avec des enzymes classiques (genre EcoRI, BamHI, etc.). Sinon, pour les PCR c'est suffisant. Je ne sais pas s'il s'est aventuré à le faire pour le séquencage.
    Blast up your life!

  24. #21
    MaliciaR

    Re : Protocole digestion

    Même question que Piwi : c'est pas un peu trop crade, ça?

    P.S. Pfff, croisement
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  25. #22
    Yoyo

    Re : Protocole digestion

    salut

    A mon avis tu te casses la tete pour pas grand chose
    En BM le plus simple marche le mieux
    1microL de ton plasmide, 1 de tampon, 1 d'enzyme et 7 d'H2O. 1h de digestion a la bonne temperature et c'est tout bon

    Sinon d'accord avec Piwi la verif par PCR sur colonies est mille fois plus simple/rapide/efficace que par digestion!

    derniere chose, n'oublie pas qu'il ne faut pas depasser 10% de ton volume total en enzyme de restriction. Sinon le glycerol qu'elles contiennent fini par totalement perturbé ta digestion (inhibition, activité star etc...).

    YOyo

  26. #23
    gorben

    Re : Protocole digestion

    Salut,

    Le top pour la digestion (selon protocole promega/ NE Biolabs, teste et approuve par tout le labo) C'est 50 uL volume final (ADN purifie, pas tout juste sorti de PCR), et max 2 uL d'enzyme. Un volume plus petit ca coupe mal, et plus d'enzyme au mieux ca change rien, au pire ca coupe mal ou avec activite star.

    Sinon pour les oligos, si je les commande le matin, je les commande le matin je les aient l'apres midi, si je les commande le soir je les recois avant d'arriver le matin... Vive les USA !

    A+

  27. #24
    MaliciaR

    Re : Protocole digestion

    Citation Envoyé par Yoyo Voir le message
    A mon avis tu te casses la tete pour pas grand chose
    Je sais, mais comme c'est mon premier protocole que je fais toute seule dans ce labo, je le chéris particulièrement

    En BM le plus simple marche le mieux
    Ici, ils sont biochimistes, donc ils font de la biomol comme ils feraient de la bioch, avec tout le côté maniac que ça comporte. Pourquoi faire simple quand on peut faire compliqué

    1microL de ton plasmide, 1 de tampon, 1 d'enzyme et 7 d'H2O. 1h de digestion a la bonne temperature et c'est tout bon
    Beh, en gros c'est ça, mais dans 25 ul volume final

    Sinon d'accord avec Piwi la verif par PCR sur colonies est mille fois plus simple/rapide/efficace que par digestion!
    Après son explication, je vois pourquoi aussi

    derniere chose, n'oublie pas qu'il ne faut pas depasser 10% de ton volume total en enzyme de restriction. Sinon le glycerol qu'elles contiennent fini par totalement perturbé ta digestion (inhibition, activité star etc...).
    J'y ai pensé, oui. Merci pour le conseil

    Citation Envoyé par gorben Voir le message
    Sinon pour les oligos, si je les commande le matin, je les commande le matin je les aient l'apres midi, si je les commande le soir je les recois avant d'arriver le matin... Vive les USA !

    A+
    Ca, vraiment...! Pas normal

    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

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