Bonjour,
J'ai rien à faire ce soir puisque toutes mes PCR réussissentalors je préparais mon protocole de digestion pour demain.
Une question : quelle quantité d'ADN plasmidique devrais-je mettre? Mon plasmide a une concentration de 150 ng/ul, j'ai fait mon calcul pour le nombre d'unités d'enzyme pour 1 ug d'ADN plasmidique. Est-ce une quantité cohérente (mon clonage ultérieur sera un peu ch****)?
Merci
Cordialement,
Si tu mets 1 unité d'enzyme et que la réaction fonctionne à 100%, tu auras 1microgramme de digéré. Je te conseille de mettre plutôt 2 unités avec 10 microlitres de ton plasmides (1,5mg), tu devrais avoir largement assez de matériel pour le clonage qui suit. Bien sûr, cela dépend de la taille de ton produit de PCR, des sites de clonages, si tu as orienté, de l'efficacité a priori de ta ligation, etc.Envoyé par MaliciaR
Bonjour,
J'ai rien à faire ce soir puisque toutes mes PCR réussissent
Une question : quelle quantité d'ADN plasmidique devrais-je mettre? Mon plasmide a une concentration de 150 ng/ul, j'ai fait mon calcul pour le nombre d'unités d'enzyme pour 1 ug d'ADN plasmidique. Est-ce une quantité cohérente (mon clonage ultérieur sera un peu ch****)?
Merci
Cordialement,
On peut en parler plus précisement si tu veux
En fait, le truc est que j'ai calculé la quantité d'enzyme et je mets 4 fois plus
Mais pas très envie de bafouiller sur mon tube de plasmide, c'est tout ce que j'aurai donc je ne veux pas en gaspiller.
Le clonage que je dois faire est un peu spécial : il est orienté, mais à moitié. Je m'explique : l'un de mes enzymes est BamHI, l'autre NcoI. Le souci est que j'ai un site NcoI au milieu de l'insert, du coup j'ai fait des PCR de demi-insert
Je vais donc faire une digestion en 2 lots : l'un avec NcoI, l'autre avec BamHI. Après le gel, j'inverse les lots et les digère avec l'autre enzyme. Enfin, clonage : je vais commencer par cloner le bout Cter contenant le site BamHI, puis je clonerai le Nter entouré par les deux extrémités NcoI. Je suis en train de fouiller pour deux enzymes à sites uniques asymétriques pour vérifier l'orientation de l'insert à la fin.
Je pense que ça de bio mol me suffira pour toute l'année
Je me demandais si cette quantité de plasmide est donc suffisante pour ce que je veux faire (c'est la toute première fois que je fais un protocole de digestion)
Cordialement,
Meuh oui, largement, surtout que ces enzymes sont courantes et coupent très bien.En fait, le truc est que j'ai calculé la quantité d'enzyme et je mets 4 fois plus
Mais pas très envie de bafouiller sur mon tube de plasmide, c'est tout ce que j'aurai donc je ne veux pas en gaspiller.
Le clonage que je dois faire est un peu spécial : il est orienté, mais à moitié. Je m'explique : l'un de mes enzymes est BamHI, l'autre NcoI. Le souci est que j'ai un site NcoI au milieu de l'insert, du coup j'ai fait des PCR de demi-insert
Je vais donc faire une digestion en 2 lots : l'un avec NcoI, l'autre avec BamHI. Après le gel, j'inverse les lots et les digère avec l'autre enzyme. Enfin, clonage : je vais commencer par cloner le bout Cter contenant le site BamHI, puis je clonerai le Nter entouré par les deux extrémités NcoI. Je suis en train de fouiller pour deux enzymes à sites uniques asymétriques pour vérifier l'orientation de l'insert à la fin.
Je pense que ça de bio mol me suffira pour toute l'année
Je me demandais si cette quantité de plasmide est donc suffisante pour ce que je veux faire (c'est la toute première fois que je fais un protocole de digestion
Cordialement,
Cool
Cordialement,
Une stratégie PCR pour screener tes clones. Tu vas avoir deux orientations possibles. Si tu designes une paire d'amorce comme celle que je t'indique tu devrais trouver tes clones.
-->--------------1-----------2
BamHI----------NcoI--------NcoI
--------------------------<--
ou
-->--------------2-----------1
BamHI----------NcoI--------NcoI
--------------------------------->
Avant ton clonage je ne peux que t'inviter à purifier plasmides et fragments PCR.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Pour cribler les clones qui sont dans le bons sens, je prendrai en sus une amorce dans le vecteur (en aval): 2 bandes = insert dans le bon sens, 1 bande= insert dans le mauvais sens, pas de bande pas d'insert
Cela permet de vérifier que tu es dans le bon vecteur, que ton produit est entier et au bon site (on sait jamais!)
Merci, Piwi! Mais c'est mieux qu'une digestion par deux enzymes de restriction (comme je le pensais)?
Ouaip, je fais la purif' demain après-midi, avant le clonageAvant ton clonage je ne peux que t'inviter à purifier plasmides et fragments PCR.
Cordialement,
L'avantage de la PCR, c'est que tu peux la faire directement sur les clones, sans passer par une étape d'extraction d'ADN. De plus, mais cela dépend de la taille de ton insert, s'il est petit tu peux galérer pour avoir digérer assez d'ADN et le voir (insert de 150 pbs, faut digérer énormément de plasmides pour le voir)
Ben disons que la restriction ca peut prendre la tête, les enzymes qui ne coupent pas, les enzymes qui ne sont pas compatibles, faire du séquentiel. La chiotte quoi.
La tu designes deux oligos (si tu ne les a pas déjà, mais à priori tu les as non?) et hop une PCR avec un hot start de 10-15 mins sur tes colonies, une 1,5h plus tard t'as fini ton screen et tu ne t'aies pas pris la tête.
Moi c'est comme ça que je fais quand je suis dans ton cas.
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Idem, et sur colonies directement
Il fait 2500 pb pratiquement, donc pas de soucis de ce côté
Je comprends l'avantage de la PCR maintenant, oui). Du coup, pour les trucs simples, j'ai fait toute seule, avec les connaissances que j'ai de la fac
Merci beaucoup pour les éclaircissements
Cordialement,
Ma chef a terminé le truc ANR hier
Pour les trucs même simples, n'hésite pas
Sigma met 2j en principe, c'est plus casse-c*** quand dans la commande, y'en a un qui a mis des trucs marqués ou une purif HPLC
Chez nous sigma met deux trois jours ouvrables à envoyer des oligos 20 mer non purifiés HPLC (inutile pour de la PCR simple).
Franchement je ne trouve pas ça long moi!
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Beh, j'ai reçu les oligos commandés mardi dernier hier! Le comble était qu'ils en avaient oublié un et que j'ai fait ma dernière PCR aujourd'hui après l'avoir reçu...!
Je ne porte pas la poisse
Ca ne m'est jamais arrivé qu'ils en oublient. Ca c'est vraiment pas de bol!
Il m'est arrivé d'avoir quelques réceptions différées mais ça reste exceptionnel.
Tu peux faire des restrictions mais tu vas être obligée de faire tes miniprep sur plusieurs clones, c'est long et chiant. Moi je préfere attendre les oligos et faire autre chose de ma matinée qu'une cinquantaine de miniprep
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
J'ai l'habitude... Il m'arrive régulièrement des trucs dont les gens sortent : "Mais c'est exceptionnel" ou "Mais ça n'arrive jamais!"...
Non, je crois qu'attendre SIGMA est plus plaisantTu peux faire des restrictions mais tu vas être obligée de faire tes miniprep sur plusieurs clones, c'est long et chiant. Moi je préfere attendre les oligos et faire autre chose de ma matinée qu'une cinquantaine de miniprep
Merci encore une fois pour les conseils
Si tu veux juste faire une digestion, tu peux faire du "boiling" pour extraire l'ADN: en gros, tu resuspends ta colonie dans de l'eau chaude, tu mélanges et tu digères
Ca marche bien ça? Ils doivent pas être terribles les profils de digestions non?
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Un collègue l'a beaucoup utilisé et c'est pas trop mal,mais avec des enzymes classiques (genre EcoRI, BamHI, etc.). Sinon, pour les PCR c'est suffisant. Je ne sais pas s'il s'est aventuré à le faire pour le séquencage.
Même question que Piwi : c'est pas un peu trop crade, ça?
P.S. Pfff, croisement
salut
A mon avis tu te casses la tete pour pas grand chose
En BM le plus simple marche le mieux
1microL de ton plasmide, 1 de tampon, 1 d'enzyme et 7 d'H2O. 1h de digestion a la bonne temperature et c'est tout bon
Sinon d'accord avec Piwi la verif par PCR sur colonies est mille fois plus simple/rapide/efficace que par digestion!
derniere chose, n'oublie pas qu'il ne faut pas depasser 10% de ton volume total en enzyme de restriction. Sinon le glycerol qu'elles contiennent fini par totalement perturbé ta digestion (inhibition, activité star etc...).
YOyo
Salut,
Le top pour la digestion (selon protocole promega/ NE Biolabs, teste et approuve par tout le labo) C'est 50 uL volume final (ADN purifie, pas tout juste sorti de PCR), et max 2 uL d'enzyme. Un volume plus petit ca coupe mal, et plus d'enzyme au mieux ca change rien, au pire ca coupe mal ou avec activite star.
Sinon pour les oligos, si je les commande le matin, je les commande le matin je les aient l'apres midi, si je les commande le soir je les recois avant d'arriver le matin... Vive les USA !
A+
Je sais, mais comme c'est mon premier protocole que je fais toute seule dans ce labo, je le chéris particulièrement
Ici, ils sont biochimistes, donc ils font de la biomol comme ils feraient de la bioch, avec tout le côté maniac que ça comporte. Pourquoi faire simple quand on peut faire compliquéEn BM le plus simple marche le mieux
Beh, en gros c'est ça, mais dans 25 ul volume final1microL de ton plasmide, 1 de tampon, 1 d'enzyme et 7 d'H2O. 1h de digestion a la bonne temperature et c'est tout bon
Après son explication, je vois pourquoi aussiSinon d'accord avec Piwi la verif par PCR sur colonies est mille fois plus simple/rapide/efficace que par digestion!
J'y ai pensé, oui. Merci pour le conseilderniere chose, n'oublie pas qu'il ne faut pas depasser 10% de ton volume total en enzyme de restriction. Sinon le glycerol qu'elles contiennent fini par totalement perturbé ta digestion (inhibition, activité star etc...).
Ca, vraiment...! Pas normalSinon pour les oligos, si je les commande le matin, je les commande le matin je les aient l'apres midi, si je les commande le soir je les recois avant d'arriver le matin... Vive les USA !
A+
Cordialement,
