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coupe de pancréas en paraffine



  1. #1
    Kerg

    coupe de pancréas en paraffine


    ------

    bonjour

    Je dois réaliser des coupes de pancréas en paraffine avec une microtome. Or, le tissu se froisse, se déchire et les coupes sont peu satisfaisante. Pourriez-me donner vos astuces pour réussir de belles coupes de pancréas de souris
    d'avance merci.

    -----

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  3. #2
    fifikz

    Re : coupe de pancréas en paraffine

    Bonjour,

    La coupe au microtome c'est toujours un peu délicat au début, il faut bien un mois ou deux pour s'y faire.

    Je te donne en vrac quelques astuces:

    avoir un bloc bien froid (au moins à -5°)
    avoir un rasoir en bon état (sinon ta coupe sera rayée)
    bien dégrossir ton bloc (pour avoir ton tissus et une surface de coupe homogéne)
    sortir un ruban assez long (4 ou 5cm) pour pouvoir le manipuler facilement
    si tu ne te sent pas d'étaler ta coupe directement sur ta lame pose ton ruban sur une feuille de papier, selectionne la coupe que tu veux étaler et prend la avec un pic. Tu n'aurra plus qu'a la déposer sur ta lame.
    Ta lame doit être sur une plaque chaude (pas trop non plus sinon ca va cuire) avec un peu d'eau dessus (eventuellement avec de l'albumine bovine qui servira de colle)
    Une fois ta coupe posée sur ce liquide laisse la s'étaler tranquillement, si il subsiste des plis tire un peu avec un pic posé sur la paraffine.
    Eponge ensuite le liquide délicatement avec du papier absorbant et remet ta lame sur la plaque chaude puis à l'étuve.

    Evite aussi les courants d'air, l'électricité statique et prend ton temps.

    Courage ça va vite rentrer!

    A+

    Fifikz
    ne pas avoir de règles c'est déjà en avoir une

  4. #3
    piwi

    Re : coupe de pancréas en paraffine

    Nos blocs sont toujours à température ambiante, je ne suis pas certain que le bloc très froid change quelque chose. Si?
    Sinon il y a l'astuce de chauffer un peu le bloc en soufflant légèrement dessus (bouche bien en O, air chaud).
    Le couteau doit être effectivement super sinon une poussière, un coup dessus et t'as gagné ta strie. Nos pro utilisent une sorte de cuvette d'eau tiède dans laquelle ils déposent leur rubans, ça déplissent vraiment bien les coupes. Personnellement je n'ose pas l'utiliser de peur de ne pas réussir à récupérer mes rubans.
    Sinon, même conseils que fifikz.
    Faut aussi faire gaffe à la déshydratation et l'inclusion. Quand ça coupe mal, ça peut venir de là aussi.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  5. #4
    fifikz

    Re : coupe de pancréas en paraffine

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Nos blocs sont toujours à température ambiante, je ne suis pas certain que le bloc très froid change quelque chose. Si?
    Si, ca change pas mal de choses, plus le bloc est dur plus la coupe sera nette (sinon pourquoi s'embeter à inclure dans un milieu solide?) pour les tissus délicats (thyroïde par exemple) on utilise même un spray réfrigérant pour durcir encore plus le bloc. Dans le labo où je bosse (labo d'anapath) on possède des appareils qui conservent les blocs à -14° avant la coupe. Essaie de mettre tes blocs au congèle avant la coupe tu notera une réelle différence.

    La cuvette ou le bain marie c'est bien aussi mais c'est plus délicat que de poser son ruban sur une feuille de papier. Solution qui permet en outre de conserver ses niveaux de coupes en cas de techniques complémentaires.

    Autre chose, fais gaffe, un microtome ca coupe, la pulpe de mes doigts peut en témoigner

    A+

    Fifikz
    ne pas avoir de règles c'est déjà en avoir une

  6. #5
    Kerg

    Re : coupe de pancréas en paraffine

    Merci pour vos réponses, je cours de ce pas mettre vos conseils en pratique.
    j'ai constaté une très grande hétérogénéïté entre les échantillons, certains passent comme une lettre à la poste, pour d'autres, c'est la croix et la banière.
    Peut être cela provient il, comme vous me l'avez déjà suggéré, de l'inclusion?

    bonne journée

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    IngDr

    Re : coupe de pancréas en paraffine

    Si les conseils prodigués plus haut ne suffisent pas, et si les échantillons sont super précieux et qu'il n'est pas possible refaire la manip, il existe un moyen permettant de limiter le froissement de la coupe : il s'agit d'utiliser un scotch spécial que tu places sur le bloc avant la coupe, et une fois la coupe faite, elle se trouve donc sur le scotch, que tu places alors sur une lame recouverte d'une colle spéciale durcissant aux UV. Apres passage aux UV, il ne reste plus qu'à enlever le scotch dans un solvant, et la coupe est bien joliment collée, non froissée sur la lame. Ca aide, mais ce n'est pas non plus un remède miracle.
    voir le site de alphelys.com, histo moléculaire

    cordialement
    Dernière modification par IngDr ; 18/03/2008 à 17h21. Motif: orthograf

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  10. #7
    fifikz

    Re : coupe de pancréas en paraffine

    Citation Envoyé par Kerg Voir le message
    Merci pour vos réponses, je cours de ce pas mettre vos conseils en pratique.
    j'ai constaté une très grande hétérogénéïté entre les échantillons, certains passent comme une lettre à la poste, pour d'autres, c'est la croix et la banière.
    Peut être cela provient il, comme vous me l'avez déjà suggéré, de l'inclusion?

    bonne journée
    Bonjour,

    C'est pas impossible dans ce cas que ce soit comme Piwi le suggére un problème en amont de la coupe. C'est peut-être un problème d'imprégnation de ton tissus, surtout si il s'éffrite. Il y a aussi la température de ta paraffine lors de l'inclusion, si tu cuit ton prélèvement la coupe peut devenir laborieuse et je parle pas non plus de l'interprétation des lames .

    Autre élément le fixateur que tu utilise, une fixation à l'alcool demande des cycles plus court qu'au formol et je ne te parle même pas des nouveau fixateur mis sur le marché depuis que le formol est devenu dangeureux....

    Courage!

    Fifikz

    PS: je connaissais pas le truc d'IngDr ça a l'air pas mal mais ça doit pas être donné.
    ne pas avoir de règles c'est déjà en avoir une

  11. #8
    Kerg

    Wink Re : coupe de pancréas en paraffine

    bonjour à tous

    Effectivement, en refroidissant le bloc, le résultat s'améliore. mais il chauffe vite, alors je suis obligé de m'y prendre en plusieurs fois en alternance avec des phases de refroidissement (congélateur). J'ai bien pris note de la technique du scotch et je vais me renseigner pour l'avenir. Merci pour vos conseils sur l'inclusion.
    En ce qui me concerne, j'utilise encore le PAF. Quel substitut vous parait le meilleur? Car à choisir, je préfère travailler en minimisant les risques.

    Bonne journée

  12. #9
    piwi

    Re : coupe de pancréas en paraffine

    Le PAF c'est la paraformaledehyde?
    Le choix que fixateur dépend de ce que vous voulez faire en fait. Que voulez vous faire?
    Sinon pour la fixation, la préparation et la conservation de la PFA sont capitales. Comment procédez vous. Une partie de vos souci peut venir de là
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  13. #10
    Kerg

    Re : coupe de pancréas en paraffine

    Dans un premier temps, de la morphométrie, dans un second temps de l'immunomarquage (insuline, glucagon)

  14. #11
    piwi

    Re : coupe de pancréas en paraffine

    Ce qui vous limite est l'immunomarquage.
    Ca vaudrait quand même le coup d'essayer vos anticorps sur des coupes fixées avec du bouin ou de la formaline qui sont des fixateurs qui préservent mieux la structure des tissus que la PFA. Parce que là, pour la morphométrie, la fixation PFA peut être un souci.

    Cordialement,
    piwi
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  15. #12
    IngDr

    Re : coupe de pancréas en paraffine

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    Ce qui vous limite est l'immunomarquage.
    Ca vaudrait quand même le coup d'essayer vos anticorps sur des coupes fixées avec du bouin ou de la formaline qui sont des fixateurs qui préservent mieux la structure des tissus que la PFA.
    piwi
    Petite question / information:
    La formaline, ce n'est qu'une solution de formaldehyde 37-40% diluée à 4% environ.
    Le PFA est la forme de stockage du formaldehyde sous forme de polymer, mais une fois dissout, c'est du formaldehyde non ?
    L'avantage du PFA, c'est qu'il est plus pur, car pour solubiliser de manière stable le formaldéhyde à 37%, en général du méthanol est rajouté, ce qui peut interférer avec les étapes en aval. En plus si mes souvenir sont bons, en solution non stabilisée, le formaldéhyde peut se convertir en acide formique, destructeur pour les tissus.
    C'est pour cela que l'on conseillle de préparer le PFA, de le congeler à -20°C, et une fois décongelé, de l'utiliser très rapidement et de jeter le reste, et ne pas le conserver au frigo

    Concernant le bouin, c'est du formaldehyde, acide picrique et autres, avec un colorant jaune. Personnellement, j'ai eu des problèmes d'immunofluo avec le bouin car il était responsable d'une fluorescence de base, vraissemblablement en raison de la présence du colorant jaune.

    Cordialement

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  17. #13
    fifikz

    Re : coupe de pancréas en paraffine

    Citation Envoyé par IngDr Voir le message
    Petite question / information:
    La formaline, ce n'est qu'une solution de formaldehyde 37-40% diluée à 4% environ.
    Oui le tout tamponné avec du phosphate mono et disodique pH 6,6
    L'avantage du PFA, c'est qu'il est plus pur, car pour solubiliser de manière stable le formaldéhyde à 37%, en général du méthanol est rajouté
    Là j'ai un doute (je vais vérifier la composition de ma solution), je crois que c'est un autre type de fixateur dont tu parle, on y ajoute aussi de l'acide acétique et l'on obtient du FAAM (je ne savais pas que c'était utilisé dans nos contrées) sans le methanol c'est de l'AFA trés anglo-saxon.
    ce qui peut interférer avec les étapes en aval. En plus si mes souvenir sont bons, en solution non stabilisée, le formaldéhyde peut se convertir en acide formique, destructeur pour les tissus.
    C'est pour éviter cela que l'on tamponne notre formaline (que j'appel formol tout court par habitude )

    Concernant le bouin, c'est du formaldehyde, acide picrique et autres
    et de l'acide acétique. Ce fixateur est assez déconseillé en routine pour une application d'IHC car l'acide picrique est assez corrosif notament pour les nucléoprotéines (mais là il s'agit de mettre en évidence insuline et glucagon donc pas de soucis je penses).

    En ce qui concerne les substituts au Formol, hormis l'alcool (100 ou 70 mais l'IHC c'est pas gagné) Il existe le glutaraldéhyde (pourquoi ce serait moins dangeureux que le formaldéhyde? Car c'est pas encore dans la liste?) et des solutions commerciales (Hydrosafe de Labonord, RCL2 de Menarini, Execell+ de MMFrance...) dont on ne connait pas les compositions exactes.
    Comme chaque fixateur produit ses propres artéfacts il te faudra adapter l'ensemble de tes procédures (ce qui soit dit en passant te rendra dépendant de ton fournisseur, à terme cela risque de te coûter cher). A noter que si tu fait de la morphométrie que ces fixateurs provoques des variations de taille trés importantes par rapport au formol et par rapport au temps de fixation.
    Pour ce qui est de l'IHC, même topo toutes les procédures sont à revoir, notamment la restauration antigénique.

    En bref, comme Piwi je te conseillerais plutôt d'utiliser de la formaline, elle est plus simple d'utilisation et marche trés bien pour l'IHC (les kits commercialisés sont d'ailleurs le plus souvent développés pour ce fixateur)

    Cordialement

    Fifikz
    ne pas avoir de règles c'est déjà en avoir une

  18. #14
    piwi

    Re : coupe de pancréas en paraffine

    Note, je conseillais le bouin sans trop y croire mais des fois ca marche en IHC. Si on doit absolument y associer une belle histologie en plus, ça vaut le coup d'essayer même si en règle générale ça ne fonctionne pas.
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  19. #15
    IngDr

    Re : coupe de pancréas en paraffine

    Citation Envoyé par fifikz Voir le message
    Oui le tout tamponné avec du phosphate mono et disodique pH 6,6

    Là j'ai un doute (je vais vérifier la composition de ma solution), je crois que c'est un autre type de fixateur dont tu parle, on y ajoute aussi de l'acide acétique et l'on obtient du FAAM (je ne savais pas que c'était utilisé dans nos contrées) sans le methanol c'est de l'AFA trés anglo-saxon.


    Fifikz

    Non non, je suis sur, c'est du méthanol, j'ai vérifié chez nos deux fournisseurs (dont Sigma). Il existe aussi des petites ampoules en verre de formaldéhydes à 10% je crois pour de la microscopie électronique qui est méthanol free, mais sinon classiquement il y a la mention "contains methanol as stabilizer"

    cordialement

  20. #16
    piwi

    Re : coupe de pancréas en paraffine

    Je confirme l'ensemble du message précédent.
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  21. #17
    fifikz

    Re : coupe de pancréas en paraffine

    Bonsoir,

    J'ai vérifié aussi il y a bien du méthanol. Ce qu craint là dedans c'est que j'ai recraché dans mon message le contenu d'un poly de cours, qui contient donc de grosses anneries et que j'ai appris par coeur.

    Merci pour la correction

    Fifikz
    ne pas avoir de règles c'est déjà en avoir une

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