Western et révélation bandes

[invite0052996b]

bonjour,
Le but de ce western est de localisé la ferroportine en comparant deux gels polyacrylamide: La migration de chaque échantillon étant réalisée dans 1 cas avec des protéines extraites de cellules non traités et dans l'autres cas avec des échantillons traités à l'hepcidine. Dans chacun des cas l'extraction est réalisée à différents temps t. Le rôle de l'hepcidine permet l'internalisation de la ferroportine et sa destruction. Donc en comparant les 2 gels (via la comparaison des bandes) on peut déterminer où se trouve la ferroportine et l'évolution de sa quantité (intensité des bandes).
Mon problème est d'un part la révélation, en effet on révèle par chémoluminescence car le gène de la ferroportine est couplé à la GFP (gène rapporteur et fluorescent naturel). Ce qui me pose pb c'est que l'on utilise un kit ECL après action d'un Anticorps II radioactif anti GFP alors qu'on pourrait détecter directement la GFP via excitation et émission (car il émet une lumière verte).
D'autre part le marqueur de taille utilisé est Dual color de chez BIORAD (catalog 161-0374) et possède 10 bandes théoriquement, du moins c'est ce que j'ai vu en prenant cette réf. Mais sur les gels on ne distingue que 7 bandes, cela est lié au % d'acrylamide et de ce fait les trop grosses et petites bandes ne se voient pas? ou alors j'ai pris une mauvaise réf. ? Avez vous utilisez ce marqueur de taille? Connaissez vous le poids moléculaire de la ferroportine, car ça m'aiderait à la localiser sur le gel qui est très très moche!
merci
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[piwi]

j'utilise le 161-0373. C'est le même que toi mais sans la double coloration.
Classiquement sur un gel à 10-12% les trois dernières bandes ne sortent pas. Ma limite se trouve donc à 25 Kd. Si on fait attention on peut quand même voir la 20 Kd mais presque collé au 25 Kd.

Cordialement,
piwi

[invite0052996b]

a merci piwi. Donc j'avais la bonne réf.
Au moins cette question est résolu étant donné qu'on a travaillé sur un gel à 10%. j'suis aussi limité à 25kd.
Mais si l'on utilise un gel à 10% c'est pour mieux identifier des protéines d'environ 100 Kd en générale? c'est quelquechose comme ça, nan?

[invite0052996b]

autres questions, si l'on ne voit pas les 3 dernières bandes cela est dû a un temps de migration trop long (et les bandes vont trop loin) ou c'est parceque le gel n'est pas assez concentré? merci

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

Plus le gel est lâche plus tu peux résoudre des protéines de grosses tailles. 10-12% ça te permet de séparer des protéines de toutes tailles. Les protéines trop petites passent toutes ensemble en revanche. C'est un peu le gel à tout faire, le gel de première intention, le gel de base quoi

[invite0052996b]

merci piwi. Quelqu'un connaitrai t-il le poids moléculaire de la ferroportine? merci

[invite400ad76c]

merci piwi. Quelqu'un connaitrai t-il le poids moléculaire de la ferroportine? merci

Bonjour

Elle aurait un poids moléculaire de 62 kDa.

http://www.jle.com/fr/revues/medecin...=Version%20PDF

Le lien conduit vers une publi sur la ferritine

[piwi]

Il y a un méthode plus systématique pour trouver le poid d'une protéine connue.

1. aller dans ensembl. http://www.ensembl.org/index.html
2. entrer le nom de votre protéine et taper entrer.
3. choisir la réponse correspondant le mieux à vos attentes. Le modèle animal considéré est indiqué en bas de chacune des réponses.
4.case "transcript" choisir [peptide info].
la structure et la séquence de la protéine est détaillée, tout en bas vous avez des infos physico-chimiques dans la case "peptide stats".
Le poid moléculaire s'y trouve.
Pour votre protéine c'est 62 884,40 da

Voilou ^_^

Cordialement,
piwi

[Vinc]

Bonjour

j'utilise le 161-0373. C'est le même que toi mais sans la double coloration.
Classiquement sur un gel à 10-12% les trois dernières bandes ne sortent pas. Ma limite se trouve donc à 25 Kd. Si on fait attention on peut quand même voir la 20 Kd mais presque collé au 25 Kd.

Cordialement,
piwi

J'utilise la même ref et je vois toutes les bandes sans exception, en 12%.

V.

[piwi]

Tu fais peut être des grands gels.

Moi j'en fais de petits, disons 8 cm, donc avec le gel de concentration ca doit séparer sur 5 cm. Les trois dernières bandes ne se séparent jamais. Peut être n'en ont elles simplement pas le temps.
Ou alors le labo aurait changer de ref sans prévenir personne (on nous distribue le marqueur de PM déjà aliquoté), mais j'en doute fort.

[invite0052996b]

merci à tous pour ces info. A+