western

[invite794baf21]

bonjour,

Pour les western blot de proteines cytoplasmiques, on utilise l'actine comme controle.
je souhaite savoir quel controle est habituellement utilisé lorsque l on souhaite effectuer un western sur des proteines nucleaires?
Merci
-----

[invite84b0382c]

Tu peux tester avec les histones H1 qui sont les histones les plus accessibles mais bon ... faut conserver ton ADN car ils y sont liés

sinon, tu as les protéines des pores nucléaires à chercher

[Vinc]

Salut!
Tu peux utiliser les lamines par exemple.
Mais on utilise pas forcément l'actine pour les cytosoliques. Ca dépend de ce qu l'on recherche, il n'y a pas vraiment de contrôle positif universel...

A+
Vinc

[invite83298aa5]

Bonjour a tous je cherche a affiner mes bandes de western .
J'ai pour cela augmenté la concentration de mon gel de separation (jusque 15% ce qui correspond à une protéine de 28Kd). Cependant certaines bandes non spécifiques restent trop larges (en hauteur) et empechent une bonne visualisation de ma bande d'interet... Je pense à changer de peigne , je voudrais utiliser un peigne à puits plus large pour que l'effet obtenu en hauteur soit diminué et aisni obtenir une bande plus fine (en hauteur ) mais plus large . Je voudrais savoir si certaines personnes ont d'autres idées!!

Merci

[A voir en vidéo sur Futura]

[Vinc]

Salut!
Peux tu scanner une photo de ton film et la poster s'il te plait! Ca sera plus pratique pour savoir exactement de quoi l'on parle!

V.

[invite83298aa5]

attends qques minutes je vais scanner et le poster
merci d'avance

[Vinc]

Je pense à changer de peigne , je voudrais utiliser un peigne à puits plus large pour que l'effet obtenu en hauteur soit diminué et aisni obtenir une bande plus fine (en hauteur ) mais plus large .

Théoriquement c'est ton staking qui doit jouer ce rôle.....
On va voir avec les photos...

C'est quoi comme manipe?? Extraits totaux? IP? Purif?....

V.

[invite83298aa5]

voila le scan (dsl le blot est plutot moche mais bon .. voila quoi ..

[invite83298aa5]

extraits totaux et visualisation de protéines endogènes

[Vinc]

Ok alors explique : quels anticorps, détaille le protocolle que tu as utilisé, etc...

V.

[invite83298aa5]

alors gel concentration 5% gel séparation 15%
Ac I (anticorps de protéine endogène fait maison) 1/200e
ac II HRP 1/5000e (attention il a deux ans... no comment ...
100µg d'echantillons

la patate est la bande non spé
la bande juste en dessous est la bande d'interet
(ici ya pas le controle mais nous on a fait avec une traduction pour verifier que ct celle la)

puits de 3-4 mm de large

[Elendilmir]

Coucou,

Les points noirs que tu as sur le blot me font penser que ton AC2 fait peut être des aggrégats, s'il a deux ans, c'est possible.
Donc avant de l'utiliser, centrifuge le quelques secondes, et ne prend que le surnageant pour ta dilution.

Et j'ai eu des bandes bizarres s'il y avait un vide de côté. Ton échantillon est entouré d'autres échantillons ou de marqueurs de taille? S'il y a un vide, ca peut expliquer que les bandes ne soient pas toujours parallèles.

Sinon pour améliorer la spécificité, je ne sais pas trop...
Ca dépend des anticorps en fait...

Tu as fait un contrôle avec seulement l'anticorps secondaire?

[invite83298aa5]

Coucou,

Les points noirs que tu as sur le blot me font penser que ton AC2 fait peut être des aggrégats, s'il a deux ans, c'est possible.
Donc avant de l'utiliser, centrifuge le quelques secondes, et ne prend que le surnageant pour ta dilution.

Et j'ai eu des bandes bizarres s'il y avait un vide de côté. Ton échantillon est entouré d'autres échantillons ou de marqueurs de taille? S'il y a un vide, ca peut expliquer que les bandes ne soient pas toujours parallèles.

Sinon pour améliorer la spécificité, je ne sais pas trop...
Ca dépend des anticorps en fait...

Tu as fait un contrôle avec seulement l'anticorps secondaire?

Hello
Hum puor l'AC2 nous venons de nous en racheter un ms je ne l'ai aps encore tester (penses tu que la centrifugation de l'AC2 pourrait ameliorer le resultat même si c'est un nouveau ac?)

pour le moment je n'ai pas fait le controle tubuline jeveux d'abord ameliorer le resultat concernant mon ac d'interet!!