Culture bactérienne troublante

[invite4747807d]

Bonjour,

J'ai effectué une transfection d'un plasmide (8.2kb) dans des bactéries super compétentes datant de 2002 (largement expirées) et dans ces même bactéries rendues fraichement de nouveau compétente.

Les deux ont intégré le plasmide correctement. Une transfection avec un plasmide controle a été réalisé. La culture bactérienne (LB+Amp) s'est faite a 37°C sur plateau shaker.

Avec le plasmide controle, la culture présentait un aspect habituel avec une solution LB trouble assez homogène. En revanche la culture avec le plasmide d'intérêt présentait de gros agglutinement de bactéries au fond de la bouteille en plus du LB trouble.
Auparavant j'avais déjà transfecté un plasmide assez proche (en dehors du gène d'intérêt: ENaC au lieu de CFTR) et je n'avais pas eu ce problème.

Personne ne semble pouvoir me l'expliquer au labo aussi je suis intéresé par vos idées.
Une hypothèse, c'est que le plasmide d'intérêt aurait modifié le métabolisme des bactéries... Mais pourquoi?

Merci d'avance!
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[gorben]

Une hypothèse, c'est que le plasmide d'intérêt aurait modifié le métabolisme des bactéries... Mais pourquoi?

Salut,

L'explication c'est bien ca. J'ai deja eu ce genre de probleme, et apres m'etre pris la tete longtemps j'ai eu la reponse. C'est un phenotype qui est du a une modification des proteines de membranes je crois. Malheureusement je ne me souviens plus du tout quelle modification. D

As tu refais la meme manip et le phenotype est il consistant? Parce que ca peut etre une mutation ponctuelle de ce gene particulier.

A+

[invite4747807d]

J'ai refait la manip 5 fois et je me retrouve systématiquement avec le même résultat: des motons bien concentrés de bactéries...

As-tu continué tes manips malgré ce changement de phénotype? Ou as-tu réussi à corriger le problème?
En changeant de souche bactérienne, penses-tu que cette modification pourrait disparaître?
Merci de me rassurer!

[invitee863e61a]

J'ai refait la manip 5 fois et je me retrouve systématiquement avec le même résultat: des motons bien concentrés de bactéries...

As-tu continué tes manips malgré ce changement de phénotype? Ou as-tu réussi à corriger le problème?
En changeant de souche bactérienne, penses-tu que cette modification pourrait disparaître?
Merci de me rassurer!

Quelle concentration en ampi a-tu-utilisé? As-tu essayé de les mettre sur boites pour vérifier que cela ressemble à des E.coli?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite153e7487]

J'ai eu exactement la même chose il y a deux ans avec des souches environnementales de E. coli (hum, sales bêtes à transformer ).

Est-ce qu'il serait possible que ton plasmide possède un promoteur qui modifie la stochiométrie de certains facteurs de transcription connus pour être impliqués dans l'auto-aggregation ou la formation de biofilms? Parfois, un plasmide inséré est présent en si grand nombre de copies qu'il peut modifier la régulation chromosomique de certains gènes en "volant" tous les facteurs de transcription... Une piste, comme ça!

A+

[gorben]

J'ai refait la manip 5 fois et je me retrouve systématiquement avec le même résultat: des motons bien concentrés de bactéries...

As-tu continué tes manips malgré ce changement de phénotype? Ou as-tu réussi à corriger le problème?
En changeant de souche bactérienne, penses-tu que cette modification pourrait disparaître?
Merci de me rassurer!

J'avais abandonne, c'etait trop chiant et meme si les autres membres du labo me certifies que c'etait ok, je trouvais ca "sale"

A+

[invite4747807d]

Quelle concentration en ampi a-tu-utilisé? As-tu essayé de les mettre sur boites pour vérifier que cela ressemble à des E.coli?

Pour l'ampiciline, je mets 0.1mg par mL de LB.
Qu'entends-tu par mettre sur boite?

J'ai eu exactement la même chose il y a deux ans avec des souches environnementales de E. coli (hum, sales bêtes à transformer ).

Est-ce qu'il serait possible que ton plasmide possède un promoteur qui modifie la stochiométrie de certains facteurs de transcription connus pour être impliqués dans l'auto-aggregation ou la formation de biofilms? Parfois, un plasmide inséré est présent en si grand nombre de copies qu'il peut modifier la régulation chromosomique de certains gènes en "volant" tous les facteurs de transcription... Une piste, comme ça!

A+

Là je dois avouer que je ne sais pas, je vais essayer de em renseigner mais d'après moi non car il s'agit du promoteur du canal CFTR (canal chlore).
Merci pour la piste!

J'avais abandonne, c'etait trop chiant et meme si les autres membres du labo me certifies que c'etait ok, je trouvais ca "sale"

A+

Je suis un peu du même avis sur la fiabilité des résultats que l'on pourrait obtenir par la suite.

[invitee863e61a]

Ok pour la concentration en Ampi.Pour les boites, je parle d'en repiquer un peu sur boites de Pétri, sur une gélose LB pour voir la tête des colonies (1 seul type de colonies?)

[invite4747807d]

Ok pour la concentration en Ampi.Pour les boites, je parle d'en repiquer un peu sur boites de Pétri, sur une gélose LB pour voir la tête des colonies (1 seul type de colonies?)

Un seul type de colonie oui.

J'ai essayé des doses de plasmides plus faibles et il semblerait qu'en dessous de 5ng/mL, les bactéries supportent mieux la transformation. En revanche, après une nuit au frigo, la mortalité (aggrégats dans le fond) reprend même à faible concentration. Je suis peut-être encore trop haut.
D'habitude vous transformez avec quelle quantitié de plasmide?

Je dois encore vérifier le pH histoire de vérifier que je ne suis pas trop loin de 7.5 et après je serai à cours d'idée...

Merci à tous.

[invite17a570c1]

Salut,

Tu as pensé de cloner ton gène (CFTR, si je ne me trompe) sur un autre plasmide? Parce que si tu le fais et que tu as le même phénotype, c'est que c'est ton gène que les bactos supportent mal. Tu me diras, si tu exprimes des canaux chlore en plus des canaux qu'elles ont déjà, ça risque de ne pas trop leur plaire... As-tu déjà essayé de transformer une souche mutante pour CFTR, pour voir si c'est ce surplus de canaux chlore qui est la cause?
Sinon, je transforme avec 20 ng/ml et c'est oki doki.

Bon courage!

Cordialement,

[invite4747807d]

Salut,

Tu as pensé de cloner ton gène (CFTR, si je ne me trompe) sur un autre plasmide? Parce que si tu le fais et que tu as le même phénotype, c'est que c'est ton gène que les bactos supportent mal. Tu me diras, si tu exprimes des canaux chlore en plus des canaux qu'elles ont déjà, ça risque de ne pas trop leur plaire... As-tu déjà essayé de transformer une souche mutante pour CFTR, pour voir si c'est ce surplus de canaux chlore qui est la cause?
Sinon, je transforme avec 20 ng/ml et c'est oki doki.

Bon courage!

Cordialement,

En fait le plasmide ne comprend pas tout le canal chlore, il ne contient que le promoteur de CFTR, associé à une firefly luciferase. Par conséquent les bactéries ne synthétisent rien de mauvais en théorie.

[invite935d76c1]

j'ai une grande question qui a plus ou moins a voir, est ce que le plamide que l'on transfecte à la bactérie risque de tuer la bactérie, je m'explique, dans vos expérience il semble que la concentration de vos plasmide soit trop important mais ce peut il que le plasmide réagisse mal avec l'adn bactérien et soit léthal ?

ce peut il alors qu'en changeant de plasmide le résultat change? et par conséquent si l'on effectue la transfection sur des bactéries des plasmides différents ayant tous les meme gene d'interret ( dans des expériences séparées sur la meme souche de bactérie) des résultats différents?


merci

[invite4747807d]

j'ai une grande question qui a plus ou moins a voir, est ce que le plamide que l'on transfecte à la bactérie risque de tuer la bactérie, je m'explique, dans vos expérience il semble que la concentration de vos plasmide soit trop important mais ce peut il que le plasmide réagisse mal avec l'adn bactérien et soit léthal ?

ce peut il alors qu'en changeant de plasmide le résultat change? et par conséquent si l'on effectue la transfection sur des bactéries des plasmides différents ayant tous les meme gene d'interret ( dans des expériences séparées sur la meme souche de bactérie) des résultats différents?


merci

Si la concentration de plasmide est trop élevée, on observe de la toxicité pour les bactéries. Cela dépend de la taille des plasmides.
La seule différence entre les plasmides ayant un même gène d'intérêt devrait être l'efficacité de transfection. Comme tu dois toujours avoir un contrôle de transfection qui ne dépend pas de tes expériences et qui te sert à relativiser, cela n'affecte pas tes résultats.

[invite4747807d]

Je viens de relire ton message et comme je ne sais plus qui le mentionnait auparavant, il se peut que la machinerie cellulaire de la bactérie lise le plasmide et synthétise des molécules qui lui serait nocives vu que les constructions sont artificielles en général.