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Point de protocole



  1. #1
    descmarc

    Point de protocole


    ------

    Bonjour,

    je vais bientot faire une overlappe PCR pour fusionner une séquence leader, une chaine légére d'anticorp et une chaine lourde. On a donc designé spécifiquement des primers que j'ai recu aujourd'hui. J'ai donc commencé par faire une PCR indépendante pour chacune des séquences. J'ai donc obtenu dans trois tubes différents mes produits de PCR. Ensuite j'ai fais un gel pour voir si j'avais amplifié spécifiquement, ce qui été le cas. Ensuite mon chef m'a demandé de purifier les séquences directement à partir du gel pour pouvoir ensuite les mélanger ensemble et ainsi faire l'overllape PCR. Vu que je sais que j'ai amplifié spécifiquement, n'était-il pas possible de centrifuger mes tubes contenant mes produits de PCR, pour avoir un culot correspondant aux séquences amplifiées, enlever le surnageant puis reprendre le culot dans quelques microlitres de tampon et enfin prendre quelques microlitres de chaque produits de PCR et les mélanger ensemble pour faire mon Ovelappe PCR??

    Avis aux habitués des ce type de manip. Y'a t'il une raison concréte pour avoir récupéré l'ADN directement à partir du gel? Est-il possible de faire comme j'ai dis?

    Merci pour vos réponses

    -----

  2. #2
    IngDr

    Re : Point de protocole

    La purification sur gel permet d'une part d'éliminer les amorces ayant servis à faire les 3 PCR indépendantes. Si elles étaient présentent dans la dernière PCR, tu aurais toutes les possibilités de PCR entre les différentes amorces, ca ferait un beau mélange...
    Je te conseille soit une purif sur gel, mais je n'aime pas trop, car les UV font des pontages, et ca peut réduire l'efficacité du clonage si tu n'es pas assez rapide pour la découpe.
    Je préfère une purif des fragments de PCR sur colonnes, qui ne retiennent que les fragments de PCR et laisse passer amorces, dNTP et enzymes... Faut juste vérifier que le type de colonne ne retient que ce qui est supérieur à 100 bases.

    Pour une précipitation (ce que je crois que tu entends par centrifuger pour avoir un culot), ca peut être une idée, à condition d'avoir les conditions qui ne précipitent que les fragments long et pas les amorces. Mais perso je préfère la technique sur colonne.

  3. #3
    MaliciaR

    Re : Point de protocole

    Bonjour,

    Je rejoins IngDr sur le conseil de purif sur colonne. En ce qui concerne la précipitation, tu devrais en faire au niveau de tes ligations si tu transformes tes bactos par électroporation : ça te permettra d'enlever les sels.


    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.

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