les ARNs et extraction

[invite0052996b]

bonjour à tous.
tout d'abord je voudrais savoir si vous connaissez les proportion d'ARNt,r et m. à priori les ARNr représente la majorité des ARN. C'est pour cela qu'on ne voit que sur gel d'agarose 1% que les ARNrs 18 et 28s et pas les autres ARN?
Sinon après migration j'obtient ce gel ci dessous.
Les échantillons sont déposés 2 fois mais à des quantité différente (les puits d'en haut contiennent moins de quantité d'ARN que les puits d'en bas). Je ne vois qu' un smear et dans tous les autres cas on ne distingue rien. Ceci est lié à une dégradation de l'ARN? Peut-on dire qu'il y a contamination avec de l'ADN ou des protéines? comment expliquer que dans un cas il y a un smear et que lorsque que l'on en dépose plus il n'y a rien? merci de vos réponses


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[invite17a570c1]

Hello,

Peux-tu préciser ton protocole? Extraction, dépôt...


Cordialement,

[invite8c0cc995]

Premièrement, a mon avis y a un soucis, c'est beaucoup trop migré et les ARN déposés en haut sont passés dans les pistes du bas non ?
sinon je n'explique pas de telles différences de migration
Ensuite je rejoints MaliciaR, il faudrait un peu plus de détails, notamment sur les quantité, le type de gel, les précautions prises (cuves passée au NaOH...), etc...

[invite0052996b]

En fait le protocole est fait de manière classique. Extraction au chloroforme d'environ 5 millions de cellules. récupération de la phase aqueuse, centrifugation et lavage et précipitation a l'éthanol. on redissoud le culot dans 10 µL d'eau. on a un rapport de pureté a peu près de 1.2. Pas terrible en plus on est susceptible d'avoir de l'ADN puisque tous les A.nucléiques absorbent à 260 nm. On est d'accord?
En fait dans les premiers puits en haut on a mis 1ug d'ARN après dilution (on le calcule a partir de la DO) et dans les puits d'en bas sont les mêmes échantillons avec 1µL de solution d'ARN (ça doit faire à peu près 10 µg). Il y a plusieurs puits car plusieurs dépôts on été fait à partir de plusieurs extraction (test de la répétabilité de la méthode). A la place du smear on devrait voir 2 bandes normalement (28 et 18 s ) c'est ça? merci

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite8c0cc995]

Quel type de cellule ?
chloroforme seul, ou phenol acide : chloroforme ? Avec du phenol acide, tu enrichis grandement en ARN, l'ADN restant dans la phase phénol. En plus, juste avec du chloroforme, vous n'éliminez pas complétement les protéines, le phénol dénature mieux.
1.2 c'est vraiment pas terrible. Le culot a- t- il été trop séché ? Avez vous laissez le culot se redissoudre ? Chauffage à 55° pendant 10 min possible pour aider à la redissolution.
Enfin, j'ai du mal à m'expliquer que vous ayez un smear de 10 cm en haut, et seulement une migration sur 3 cm en bas. Surtout vu l'intensité des bandes en bas, même avec 10x moins, vous auriez du avoir quelque chose en haut.
A mon avis, vos bandes du haut sont dans la 2ème moitié (en bas), et celle de la 2ème moitié dans le tampon (hors du gel quoi) ... Quelqu'un pour confirmer mon impression ?

[invitec9f0f895]

Enfin, j'ai du mal à m'expliquer que vous ayez un smear de 10 cm en haut, et seulement une migration sur 3 cm en bas. Surtout vu l'intensité des bandes en bas, même avec 10x moins, vous auriez du avoir quelque chose en haut.
A mon avis, vos bandes du haut sont dans la 2ème moitié (en bas), et celle de la 2ème moitié dans le tampon (hors du gel quoi) ... Quelqu'un pour confirmer mon impression ?

Completement d'accord!
les bandes d'en bas sont celles du haut qui ont trop migres!
CA veu dire que tous les ARN sont dégradés...

YOyo

[invite17a570c1]

Clair, ton impression est bonne, IngDr
Une question très bête : pourquoi ne pas avoir fait une extraction avec de la DNAse? C'est plus propre, il me semble


Cordialement,

[invite0052996b]

Bonjour merci pour ces info.
Pour commencer la séparation s'est faîte avec du chloroforme seulement. Le phénol n'était pas indispensable puisque l'on utilisait de la guanidine (couleur rose) + NaCl à pH basique. A ce pH l'ADN est + affine pour la phase inferieur (rose) et la phase supérieur contient l'ARN. En tout cas j'ai compris ça de l'extraction à la guanidine. Donc la phase supérieur c'est de l'eau à pH neutre avec l'ARN? Par contre on aurait pu en effet utiliser des Dnases, c'est vrai. J'en prends note pour l'amélioration de la technique.
par contre l'histoire du smeaur est étonnante je ne dirais pas que l'ARN soit hors gel mais totalement dégradé (c'est vrai que c'est étonnant qu'il y ai un smear dans le haut du gel avec un quantité moindre). En fait pour moi ce qui est en rouge devrait être l'emplacemenent du 28 et 18S et en vert et bleu l'ARN dégradé das autres puits. Par contre j'comprends pas pourquoi il y des distances de migration différentes (cercle vert et bleu) Merci

[invite0052996b]

bonjour,
personne n'a d'idées? Sinon comment améliorer cette extraction?

[piwi]

En fait ce que vous faites c'est que vous faites vous même votre tri-reagent (connu sous le nom de trizol chez invitrogen mais que vous pouvez trouver à l'identique en beaucoup moins cher chez d'autres fournisseurs).
Je vous invite à en utiliser du tout prêt ça vous évitera des variations difficilement évitables.

Ensuite une bonne chose à faire est d'utiliser une bonne quantité de tri-reagent. Plus vous en mettez plus vos ARNs seront propres. De la même manière vous n'avez pas grand chose à craindre à laisser relativement longtemps votre broyat dans la solution. En général je l'oublie sous la hotte une bonne vingtaine de minutes au minimum. Le temps aide à lyser ce qui ne l'était pas au bout de 5 minutes.

Personnellement je ne fais pas de précipitation à l'ethanol pour les ARNs mais à l'isopropanol. Ensuite je rince le culot à l'ethanol 70%

Il ne faut pas laisser secher trop longtemps.

Je n'ai jamais eu le moindre souci avec mes ARNs en procédant de la sorte.

Cordialement,
piwi

[invite0052996b]

vous pouvez expliquer brièvement le principe du kit, produit utilisés entre autres et leurs modes d'actions. merci

[invite0052996b]

merci PIWI.
Autre p'tites questions: dans ce TP on n'a pas utilisé de phénol (élimine les protéines). Dans ce cas dans la phase aqueuse on a donc de l'ARN et des protéines, nan? Ou alors la dénaturation des protéines par la guanidine fait que les protéines ne sont plus dans la phase supérieure. Car nous avions que 2 phases (la phase rose guanidine et la phase aqueuse)et une interface. De plus l'interface c'est de l'eau ou du chloroforme? normalement la phase inférieure c'est le chloroforme, mais pourquoi cette phase est de la couleur de la guanidine?

[piwi]

protocole de chez invitrogen: http://www.invitrogen.com/content/sf...t%20061207.pdf

Une référence qui dit tout ce que vous devez savoir:
http://www.nature.com.gate1.inist.fr...ot.2006.83.pdf

ref:
Chomczynski P, Sacchi N. Nat Protoc. 2006;1(2):581-5.
The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.

Cordialement,
piwi

[invite0052996b]

merci piwi mais je n'arrive pas à avoir la publication il faut un login. Quelqu'un connaît t-il le rôle de l'extraction à la guanidine/NaCl + chloroforme seulement. j'comprends pas bien où sont les protéines, l'ARN et l'ADN. à priori vu que le pH est basique l'ADN restera préférentiellement dans la phase inférieure. merci