Bonjour, bonjour !
Après avoir usé d'une unitée plus que reconnue; le pifomètre; je m'adresse à vous pour augmenter mes probabilités de réussite !
Dans le but de faire un western-blot avec un anticorps (polyclonal) je me lance dans des extractions de protéines. Seulement (pas de bol) ma protéine d'intéret est ancrée dans le peptidoglycane de ma bestiole de façon covalente (motif LPXTG). Pour info je bosse sur une bactérie G+ qui a la mauvaise idée de résister au lysozyme.
Le point sur ce que j'ai déja fait :
=> une extraction de protéines totales, classique, mais qui malheureusment me donne un signal pas top (pas mal de non spé)
=>une extraction de protéines pariétales "maison" afin de réduire le pool protéique mais qui me donne pas assez de protéines...
Pour cette dernière extraction j'ai bossé sur 100mL de culture à DO=0,5 que j'ai lavé dans un tampon (tris, PMSF, Beta-mercapto) puis j'ai utilisé un tampon d'extraction (tris, beta mercapto, 25% sucrose et mutanolysine). Je n'ai pas utilisé de lysozyme car la bactos résiste à 20mg.mL donc je vais juste blinder mon milieu de lysozyme. J'ai incubé la mutanolysine pendant 1h30 puis j'ai récuperé le surnageant après une centri "douce" pour pas eclater les "protoplastes" mais... sans suffisament de protéines !
J'ai une ou deux idées sous le coude : partir sur des volumes d'extraction + importants et précipiter les protéines au TCA ? tenter un protocole d'extraction des protéines en pH alcalin ?
Cependant je suis certain que cette manip se fait en "routine" dans pas mal de labo ce pourquoi je suis sur que vous me serez de bon conseils ! Pour info je n'ai pas à disposotion d'ultracentrifugeuse et ma mutanolysine est clean !
Merci pour vos idées/infos etc...
Maïcrob'
-----
