Transfection et induction

[invite75bf7adf]

Bonjour tout le monde.

J'aimerais vous poser deux petites questions (qui n'ont d'ailleurs rien à voir l'une avec l'autre).

Alors voilà, pour commencer j'envisage de faire des trasfections de HEK 293 par un plasmide codant une protéine parasitaire et conférant un tag HA afin de voir si elle active la voie NF-kB (gràce à un plasmide rapporteur et test luciférase).
Est-ce que ça a un sens de transfecter aussi par le même vecteur sans insert (pour voir si c'est pas plutot le vecteur responsable de l'activation)?
Car en fin de compte mon tag HA tout seul, il sera quand même bien synthétisé dans ma cellule, n'est-ce pas?

Mon deuxième problème concerne la production en BL21 d'une protéine clonée.
J'ai du mal, déjà à la produire, et d'autre part à la solubiliser.
J'ai vu sur le site d'invitrogen qu'ils préconisent dans ces cas là d'abaisser la température lors de l'induction et de diminuer la quantité d'IPTG. Est-ce que quelqu'un pourrait m'expliquer exactement pourquoi?

J'espère que la longueur de mon message ne vous a pas fait fuire... Merci d'avance à ceux qui pourront me répondre.
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[IngDr]

En ce qui concerne le vecteur vide, c'est un bon controle à faire, car comme tu l'as précisé, cela montre que le HA n'a pas d'effet. Cela peut sembler trivial, mais ce sont des controles demandés.

[invite75bf7adf]

Salut

merci pour ta réponse.
Pour être plus précise on m'avait conseillé aussi d'utiliser une protéine dont je sais qu'elle n'active pas cette voie, elle-même taggée HA. Malheureusement je n'en ai pas de disponible en ce moment. Mais d'après ce que tu me dis, ce n'est pas nécessaire: mon vecteur vide est un suffisament bon contrôle, c'est ça?

[invite8c1e373f]

Salut

Je vais essayer de répondre à la seconde question. C'est vrai que j'ai toujours entendu qu'il fallait baisser la température pour augmenter la solubilité des protéines mais sans avoir vraiment la raison (ah la la c'est pas bien d'appliquer bêtement quelque chose, sans en chercher le pourquoi du comment lol).

Il faut pas oublier que des protéines d'origine eucaryote peuvent être toxiques pour les bactéries. Donc en diminuant la concentration en IPTG, l'induction sera moindre. La concentration en protéines recombinantes sera donc plus faible et par conséquent moins toxique.
Cette concentration joue également sur la solubilité, car si elle est trop importante les protéines ont plus de chance de s'agréger dans des corps d'inclusion.
Par ailleurs, en bactéries les protéines récombinantes ne subissent pas les modifications post-traductionnelles qui peuvent être nécessaires à leur conformation tridimensionnelle (et/ou leur activité). Je pense que ça peut également jouer sur leur solubilisation, de même que la présence d'un tag pour la purification.

Une des alternatives est la production en levure, qui reste peu onéreuse et facile à mettre en place, comme pour les bactéries. De plus la culture se fait à des températures optimales de 25 à 30°, en plus d'être dans un système eucaryote.

enfin les propriétés physico-chimiques des protéines varient en fonction de la température, elles sont surement plus favorables à une témpérature moindre.

voici quelques pistes. j'espère que j'ai pas dit de bétises

[A voir en vidéo sur Futura]