Purification methioninase

[invitedcc4abb0]

Bonjour
Je suis chargé d'ameliorer une purification mais ayant des connaissances limitées dans ce domaine j'aimerai avoir un maximum d'informations.
Après avoir obtenu ma proteine je la purifie grâce a une chromatographie histag puis j'effectue une dialyse(3h) un cleavage de la partie N_terminal his_tag suivi par une seconde chromatographie et enfin je fait une seconde dialyse(3h).
Tout au long de cette manipulation j'ai une perte d'activite consequente.
J'aimerai savoir toutes les precautions a prendre pour ameliorer cette purification.
Merci beaucoup
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[Zellus]

Bonsoir,

Il n'y a pas très longtemps que je fais des purifications mais je vais quand même essayer de t'aider .
Je ne sais pas à quelle température tu fais ta purif mais tu peux voir si ça améliore les choses en la diminuant par exemple.

Après avoir obtenu ma proteine je la purifie grâce a une chromatographie histag puis j'effectue une dialyse(3h) un cleavage de la partie N_terminal his_tag suivi par une seconde chromatographie et enfin je fait une seconde dialyse(3h).

Le mieux c'est que ta purif dure le moins de temps possible. Tu pourrais essayer de faire ton clivage directement sur la colonne, ça ferait gagner 3h de la première dialyse.
A part ça, on ajoute souvent 1 mM de DTT ou de mercapto-éthanol dans le tampon de nos protéines pour éviter qu'elles ne s'oxydent trop rapidement. Et quand je purifie une protéase, je rajoute aussi 10% v/v de glycérol pour la stabiliser.

Voilà, j'espère que ça peut t'aider.
Cordialement,
Zellus

[invitedcc4abb0]

merci
mais je me demande comment tu fais le clivage dans la colonne.

[invitedcc4abb0]

je recherche comment effectuer le cleavage dans la colonne mais sans resultat si tu quelqu'un peut m'aider merci

[A voir en vidéo sur Futura]

[Zellus]

Salut,

Pardon pour le retard .
Au passage, tu peux essayer de changer la composition de ton tampon pour obtenir les conditions optimales pour ton enzyme aussi. Moi j'ai souvent du KCl à 200 mM et du Tris-HCl à 20 mM pH 7,5, mais chaque potéine peut se comporter différemment donc bon... Tu as peut-être des indications sur Pubmed dans des articles sur la méthioninase.

Maintenant, le clivage. Je fais mes purifs par FPLC, et je ne sais pas quel système de chromatographie tu utilises, mais l'idée reste la même. Après avoir fixé ta protéine et lavé avec du tampon, il faut que tu équilibres ta colonne avec le tampon dont a besoin ta protéase (moi j'utilise celle du TEV). Il se trouve que la TEV fonctionne bien dans mon tampon de purif donc j'ai pas besoin de le changer pour ma part . Si tu peux faire la même chose c'est aussi bien.
Donc, une fois que ta colonne est équilibrée, tu fais passer ta protéase dans ta colonne. Là c'est pareil, vu que je produis ma TEV, je peux en utiliser une grosse quantité et donc j'ai pas besoin de laisser agir longtemps. Cependant, dans certains protocoles, la digestion peut se faire la nuit dans la colonne (fermée en bas bien sûr).
Après clivage, tu vas "pousser" avec du tampon et ta méthioninase va partir en même temps que ta protéase. Il faut en fait utiliser une deuxième colonne que tu fixes à la suite et qui va te permettre de fixer une des deux protéines. C'est à toi de voir ce qui est le mieux comme colonne pour éviter que les deux se fixent (échangeuse d'anions, de cations ...).

Bon je m'arrête là pour le moment vu la taille du pavé lol. Et si tu as des questions j'y répondrai.
Salut !!

[invitedcc4abb0]

merci beaucoup pour toutes ces informations