Technique Laurière et Western Blot

[invite6f6362db]

Bonjour,

Je suis actuellement entrain de tester la technique de Laurière en Western Blot, pour transférer des protéines d'un gel de polyacrylamide sur une membrane de nitrocellulose.

Le transfert fonctionne, mais les marqueurs de haut PM ne se transférent pas, seul ceux de petits PM sont transférés.
Le problème est que les petits traversent la membrane du coup puisque j'augmente l'ampérage pour essayer de faire sortir les hauts PM du gel.

D'où peut provenir le problème ?

J'utilise un Trans Blot de type SD 3880 de chez Biorad.

Merci pour vos réponses.
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[Vinc]

Bonjour.

Ce problème n'en est certainement pas un : vous augmentez l'ampérage pour transférer les grosses protéines donc les petites protéines ont suffisamment de temps pour traverser la membrane. Il n’y a rien d’illogique.

Il vous faut optimiser votre ampérage/temps de migration afin d'avoir un équilibre grosse protéines transférées/petites protéines perdues.

Vous pouvez également pousser le temps et le courant au maximum pour avoir la totalité de vos grosses protéines et faire sortir complètement vos petites protéines et rajouter une seconde membrane derrière la première pour faire un western sur les deux en parallèle:
- grosse protéine sur la membrane en contact avec le gel
- petites protéine sur la deuxième membrane


V.

[invite6f6362db]

Merci beaucoup pour votre réponse rapide.
Je vais essayer demain de mettre une autre membrane derrière et je vous dirais ce que cela donne

[Yoyo]

salut

sinon tu peux aussi utiliser une membrane avec des pores plus petits?

YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]