Extraction de l'ADN de cellules eucaryotes, lyse

[invite3f45a971]

Bonjour à tous,
J'ai un Bac+2 en biochimie et je prépare actuellement un concours.
Je cherche depuis un bon moment sur internet et sur le forum une réponse à ma question, sans succès. Alors je me suis décidée à m'inscrire et à créer une nouvelle discussion !

C'est à propos de l'extraction de l'ADN des cellules eucaryotes :
il faut tout d'abord réaliser une lyse des cellules...

mais comment réaliser cette lyse ?
j'ai vu que l'on pouvait utiliser de l'urée, du SDS, de l'EDTA, du NaCl et de la protéinase K... il faut tous ces produits pour lyser la cellule? ou seulement une partie et dans ce cas là lesquels sont nécessaires ?
est-ce que le chelex intervient ? si oui comment ?
le choc thermique permet-il une lyse sans endommager l'ADN?

le phénol et le chlorophorme permettent de solubiliser d'une part les protéines et les lipides d'autre part, cela fait partie de l'extration à part entière ou bien ces produits interviennent-ils également dans la lyse des cellules ?

dans l'exemple de cellules issues de l'épithélium de la bouche par exemple, quel traitement feriez-vous subir à votre échantillon pour extraire l'ADN ?

Je sais qu'il y a beaucoup de questions mais en fait tout tourne autour de la lyse des cellules lors de l'extration de l'ADN !
Merci beaucoup pour vos réponses !!
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[invite59c4064c]

salut
pour repondre et de ce je sais tu n'est pas obliger d'utiliser tous ces produits pour effectuer une lyse cellulaire (si tu parle bien de l'eclatement de la cellule pour recuperer son contenu ,ADN etc).
Tu peux lyser tes cellules par sonications et recuperer un lysat celulaire!
tu peux egalement effectuer un choc osmotique(qui consiste a mettre tes cellule dans un milieu hypotonique) ainsi un flux d'eau entre dans tes cellules ,gonfle et eclate par choc osmotique
d'autre methode existe..

[invite3f45a971]

merci beaucoup pour ta réponse
oui je parle bien de l'éclatement de la cellule pour en récupérer le contenu

par rapport au milieu hypotonique, comment le créer?
je sais que l'osmolarité du milieu intracellulaire est de 300 mOsm, mais comment faire le lien avec la concentration?

si on prends de l'eau par exemple, est-ce que l'on aura fait une bonne lyse ?
désolée pour ttes ces questions !

[invite186e1b0b]

Salut!

POur la lyse osmotique (souvent pour des cellules eucaryotes animales plus quelques exceptions).

Elle consiste à placer tes cellules dans un milieu hypotonique (de l'eau distillée c'est parfait).

Le but est d'avoir un milieu ou la concentration ionique/moléculaire est moindre à l'extérieur de ta cellule !

L'eau rentre dans ta cellule et boum !

amicalement,

Greg

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite3f45a971]

ok merci beaucoup !!

et qu'en est-il du chelex alors... ? peut-être la même action que l'eau distillée ?

pour la suite du protocole d'extraction d'ADN, on utilise le phénol et le chlorophorme à partir de notre lysat cellulaire c'est bien ça ? ou bien doit-on préalablement centrifuger pour éliminer l'eau ... ?