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Microsatellite genemapper



  1. #1
    Bacillus 100

    Unhappy Microsatellite genemapper


    ------

    Bonjour,

    Je commence à mettre au point une nouvelle technique dans mon laboratoire et j'ai quelques difficultés en gros j'ai besoin de votre aides !
    Voila:
    Bon But: Etude de liaison génétique pour une maladie au sein d'une grande familles

    J'ai choisis des microsatellites pour un chromosome qui nous intéresse (on pense que sa pourrait être le chromosome impliqués dans la maladie et on veut le vérifier). Ces microsat je les ai choisis avec un % hétérozygotie elevés style 80%

    J'amplifie des microsatellite avec un couple d'amorces le forward est marqués FAM en 5'

    Je dépose ceci sur un séquenceur automatique avec un marqueur de taille fluorescent. Les résultats apparaissent sous forme de pics de fluorenscence en fonction de la taille sur un logiciel qui s'appelle genemapper

    le problèmes c'est que certes j'ai 2 pics majoritaires qui je pense est probablement mes 2 alléles mais j'ai plein d'autres pics. artefacts? alléles? comment expliquer les artefacts?
    J'arrive pas à intérpreter mes résultats j'ai plein de pics je sais pas si il faut que les considérer ou pas

    du coup je me suis dis il faut que je connaisse le nombre de répétition de CA donc peut être faire du séquençage directement et la je fais le séquençage et c'est super difficile! enfin si vous voulez je connais exactement le nombre de répétition pour un alléle mais pas pour l'autre alléle car l'hétérozygotie est difficile à voir sur la séquence et j'arrive pas vraiment à compter surtout que certains patients pour certains marqueurs on à un nombre de répétition pas trés différent

    enfin je sais pas si vous avez compris ou je veux en venir. En tous cas maintenant je sais plus vraiment quoi faire

    Avez- vous des conseils à me donner?

    Merci

    -----

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  4. #2
    t0yt0y

    Re : Microsatellite genemapper

    Bonsoir,

    Je ne pense pas avoir encore le niveau pour t'aider, mais si j'ai bien compris, sur ton logiciel tu as l'impression qu'il y a plusieurs types de microsatellites ( nombre de répétition différent ) ?

    Mais es-tu sur de n'avoir qu'un seul microsatellite ?
    Tu fais ton amplification sur quoi ? En quelle quantité ?

    Moi de prime abord je vérifierais avec un truc tout con genre éléctrophorèse si tu n'as pas plusieurs microsatellites ou alors des duplications.

    Bonne chance
    Allo, Stérique ?! Oui ... Ici Nétique !!!!

  5. #3
    Borh

    Re : Microsatellite genemapper

    tu as des captures d'écrans ?
    Généralement quand tu amplifies un microsat, tu as un grand pic qui correspond à sa taille, suivi de quelques pics décroissants situés chacun à une répétition de moins. Ca vient du fait que la Taq fait des erreurs quand elle amplifie des répétitions.

    Par contre si les pics sont placés n'importe où, là je sais pas. Est-ce que tu as passé tes primers sur BLAST pour vérifier qu'ils n'amplifient pas d'autres fragments ?

  6. #4
    Bacillus 100

    Re : Microsatellite genemapper

    mes primers ont été blastés dans un premiers temps et dans un second temps les produits PCR sont déposés sur gel agarose et j'ai bien une unique bande propre donc ceci c'est réglés.
    Oui les erreurs de glissement de la taq c'est fortement possible mais difficile à voir car j'ai un pic majoritaire entourés de plusieurs pics +ou moins majoritaires sur une région de 10pb. Quel taq puis-je utiliser pour éviter les erreurs?

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