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Dilution d'ADN "contaminante"?




  1. #1
    LaurianeR

    Question Dilution d'ADN "contaminante"?

    Bonjour,

    J'ai quantifié des ADN au spectrophotomètre mais, étant un peu visqueux (trop concentrés) la mesure a été un peu faussée. Je décide donc de diluer mes ADN au 1/10 avec de l'eau milliQ (ultrapure).
    Là, mes quantifications sont correctes (double mesure cohérente), mais mes rapports de pureté 260nm/280nm diminuent...
    Mes ADN dilués seraient donc contaminés (206/280 = 1.65) et pas mes solutions mères d'ADN (260/280 = 1.79)

    Quelqu'un saurait-il d'où cela peut venir??

    Merci d'avance pour vos réponses!

    -----


  2. Publicité
  3. #2
    jmbowie

    Re : dilution d'ADN "contaminante"?

    Citation Envoyé par LaurianeR Voir le message
    Bonjour,

    J'ai quantifié des ADN au spectrophotomètre mais, étant un peu visqueux (trop concentrés) la mesure a été un peu faussée. Je décide donc de diluer mes ADN au 1/10 avec de l'eau milliQ (ultrapure).
    Là, mes quantifications sont correctes (double mesure cohérente), mais mes rapports de pureté 260nm/280nm diminuent...
    Mes ADN dilués seraient donc contaminés (206/280 = 1.65) et pas mes solutions mères d'ADN (260/280 = 1.79)

    Quelqu'un saurait-il d'où cela peut venir??

    Merci d'avance pour vos réponses!
    Tu as fais une seule mesure de chaque dilution? La différence n'est pas forcément significative
    Blast up your life!

  4. #3
    MaliciaR

    Re : dilution d'ADN "contaminante"?

    Ce que je ne comprends pas c'est comment tu peux estimer que tes solutions diluées sont contaminées en comparaison avec tes solutions mère alors que tu dis toi-même que les mesures au niveau des solutions non diluées sont biaisées...


    Cordialement,
    An expert is one who knows more and more about less and less.


  5. #4
    Zellus

    Re : dilution d'ADN "contaminante"?

    Salut,

    +1 pour Malicia
    Sinon, au labo, pour avoir une meilleure estimation de la concentration d'ADN, on mesure l'absorbance également à 320 nm. A cette longueur d'onde l'ADN n'absorbe pas donc la valeur devrait être nulle. On fait donc la soustraction A260-A320 pour obtenir la "vraie" absorbance à 260 nm.
    Je ne sais pas si tu as fait ça mais ta différence peut venir de là.
    J'espère avoir été clair .

    Cordialement,
    Zellus

  6. #5
    MaliciaR

    Re : dilution d'ADN "contaminante"?

    Merci, Zellus

    Autre chose : pour que ton ADN dilué soit contaminé comme tu le supposes, il faudrait que ta MilliQ soit contaminée par un truc qui absorbe à 260 nm Ca fait un peu trop de particularités là...


    Cordialement,

    P.S. Au fait, je suis plutôt curieuse de savoir quelle technique tu utilises pour obtenir une telle quantité d'ADN que ta solution en soit visqueuse...!
    An expert is one who knows more and more about less and less.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    IngDr

    Re : dilution d'ADN "contaminante"?

    Pour la contamination de l'eau milliQ, normalement le blanc se fait sur cette même eau, donc s'il y a un contaminant dedans, de toute facon il n'est pas pris en compte.
    Plutot que de nous donner le rapport 260/280 donne nous les valeurs @ 260 et 280 nm dans les 2 cas, histoire que l'on sache d'ou vient le pb, : si ton rapport diminue, c'est soit le 260 qui augmente ou le 280 qui diminue.

    Pour MaliciaR : ADN visqueux = culot après précipitation à l'Ethanol mal resuspendu, ou présence d'ADN génomique (volontaire ou non !). Pour aider, il est possible d'incuber @ 50°C pendant 10min pour aider à la resuspension. Dans le cas d'ADN génomique, on peut soniquer (tout dépend des applications que l'on veut faire après, mais 10-30s suffit largement)

  9. #7
    Zellus

    Re : dilution d'ADN "contaminante"?

    Re,
    pardon j'ai oublié de dire que les protéines n'absorbent pas non plus à 320 nm donc tu calcules aussi A280-A320 et tu peux ainsi calculer le rapport A260/A280.

  10. Publicité
  11. #8
    LaurianeR

    Re : dilution d'ADN "contaminante"?

    Bonjour!
    Je vais répondre un peu à tout vos messages

    Citation Envoyé par MaliciaR
    Ce que je ne comprends pas c'est comment tu peux estimer que tes solutions diluées sont contaminées en comparaison avec tes solutions mère alors que tu dis toi-même que les mesures au niveau des solutions non diluées sont biaisées...
    C'est vrai, mais les rapports 260/280 sont très peu affectés (variation de 0.01 entre mes 2 rapports A260/A280) alors que les concentrations bougent de 408ng/µl à 550 ng/µl entre mes 2 mesures pour un même ADN...

    Citation Envoyé par Zellus
    On fait donc la soustraction A260-A320 pour obtenir la "vraie" absorbance à 260 nm.
    Je ne sais pas si tu as fait ça mais ta différence peut venir de là.

    pardon j'ai oublié de dire que les protéines n'absorbent pas non plus à 320 nm donc tu calcules aussi A280-A320 et tu peux ainsi calculer le rapport A260/A280.
    Je ne l'avais pas fait, mais après soustractions et redivisions, c'est un peu mieux pour les rapports (A260-A320)/(A280-A320). Mais les différences sont toujours à peu près les mêmes...
    Merci quand même pour l'info

    Citation Envoyé par MaliciaR
    Autre chose : pour que ton ADN dilué soit contaminé comme tu le supposes, il faudrait que ta MilliQ soit contaminée par un truc qui absorbe à 260 nm Ça fait un peu trop de particularités là...

    Cordialement,

    P.S. Au fait, je suis plutôt curieuse de savoir quelle technique tu utilises pour obtenir une telle quantité d'ADN que ta solution en soit visqueuse...!
    J'avais, comme toi, émis l'hypothèse de l'eau que j'ai très vite abandonnée vu que c'est avec elle que j'ai fait mon blanc.
    Sinon, j'ai extrait mes ADN à partir de tissus animaux lysés 3h à 55° au bain-marie, puis phénol/chloroforme avec des tubes contenant un gel bloquant la phase P/chlo (très pratique) et Éthanol précipitation avant de reprendre mon culot dans de l'eau.

    Avec ces nouvelles infos, avez-vous une idée du pourquoi les rapport baisent avec la dilution?

  12. #9
    piwi

    Re : Dilution d'ADN "contaminante"?

    A mon avis la différence est bêtement non significative. Ca ne vaut pas la peine de se faire suer plus que cela pour votre petite variation.
    Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.

  13. #10
    IngDr

    Re : Dilution d'ADN "contaminante"?

    Citation Envoyé par piwi Voir le message
    A mon avis la différence est bêtement non significative. Ca ne vaut pas la peine de se faire suer plus que cela pour votre petite variation.
    Tout à fait d'acc, exactement pour ca que je veux voir les valeurs de DO.

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