Bonjour à tous,
je fais des extractions d'ADN à partir de sang humain et j'aimerai savoir si je peut remplacer la protéinase K par une autre enzyme moins cher...
au fait je suis d'Algérie et la protéinase K coute cher ici dont les 320 euro (en plus le budjet est trés trés limité...)
j'aimerai également savoir combien cette enzyme coute en france par exemple?
merci
Salut
Generalement pou run extraction d'ADN on n'a pas besoin de proteinase K? a moins que ca ne soit une spécificité des cellules sanguines?
Sinon le phneol/chloroforme est souvent utilisé pour dénaturer les proteines.
Yoyo
En general il n'est pas obligatoire d'utiliser la proteinase K, mais c'est vrai que personnellement je n'ai jamais utilise de sang...c'est peut etre un peu different.
L'extraction phenol/chlorophorme permet en general de separer la phase acqueuse (ou se concentrent les acides nucleiques) et la phase organique (dans la quelle les proteines se solubilisent plus facilement que les acides nucleiques apres avoir ete denaturees par le phenol).
La digestion proteolytique (prot K par exemple) est parfois utilisee pour parfaire la purification en particulier des proteines interagissant fortement avec l'ADn, moi je n'ai jamais eu de probleme sans.
Salut,
Juste comme ca, quel type d'ADN on peut recuperer dans le sang, je croyais que les hemacies etaient anuclees? Cellules immunitaires?
A+
1-les hematies sont enuclees mais pas les leucocytes...Salut,
Juste comme ca, quel type d'ADN on peut recuperer dans le sang, je croyais que les hemacies etaient anuclees? Cellules immunitaires?
A+
2-les hematies sont enuclees mais pas chez toutes les especes animales (les oiseaux par exemple ont des hematies avec noyau je crois...)
On utilise la PK O/N à 65°C pour les biopsies de queue ou de peau afin d'établir le génotype de nos animaux par PCR.
J'ai du mal à imaginer le résultat des extractions d'ADN si nous ne le faisions pas.
Le phénol suffirait à liberer l'ADN? Il faudrait peut être broyer comme pour le trizol. Mais dans ce cas, si il faut pistonner toutes les biopsies bonjours le boulot quand y en a une centaine... Deja que l'extraction prend du temps quand y en a une masse.
Le prix hors taxe de celle que l'on a au labo (Roche) est effarant, pas loin de 500€ hors taxe!
Cordialement,
piwi
Oui, certains protocoles ont leur etape de lyse qui utilise la PK, mais un tissu comme le sang depourvu de tissu conjonctif, matrice extracellulaire...ne devrait pas etre aussi difficile a lyser! Les detergents forts et/ou des passages en seringue avant le phenol/chlo devraient suffir j'imagine.On utilise la PK O/N à 65°C pour les biopsies de queue ou de peau afin d'établir le génotype de nos animaux par PCR.
J'ai du mal à imaginer le résultat des extractions d'ADN si nous ne le faisions pas.
J'avais mal lu le premier message et je n'avais pas repéré que c'était du sang dont il était question. Je pensais que la discussion avait dans un second temps dérivé sur ce sujet.
Pour le sang j'ai un doute aussi, un fort passage en centri ou même le seul phénol devrait faire l'affaire pour tout faire exploser. En plus j'ai peur que la PK ne dilue encore plus les quelques cellules nuclées qui trainent et n'augmente les pertes lors des différentes étapes.
Cordialement,
piwi
