Clonage TOPO dans JM-109

[Frikie]

Bonjour à tous et toutes,
mon soucis est le suivant:
J'essaye en ce moment de cloner un fragment d'environ 1400 pb.
J'ai effectué la ligation dans le vecteur topo pCR®2.1 et la transformation dans des bacteries compétentes JM-109 (via choc thermique).
Or aucune des bacteries ne pousse sur mes boites IPTG / X-Gal/Amp.
Il s'agit a priori d'un problème de transformation puisque la résistance à l'antibio n'est pas acquise mais quelle en est la raison???
Si quelqu'un a une piste je suis preneuse.
Merci
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[jmbowie]

Il peut aussi s'agir d'un problème de ligation, car ton vecteur doit se re-circulariser pour se répliquer et conférer la résistance.

[Zellus]

Salut,

Quel est ton protocole de transformation ?
Sinon, une autre possibilité est que l'ampicilline est trop concentrée dans tes boîtes de Petri.

[Frikie]

Bonjour,
le protocole c'est du grand classique ligation (vecteur+insert (purification)+solution de sel) . 15 min à température ambiante. Puis transformation avec choc thermique (45 sec à 42°C).
Les bactéries poussent en préculture (milieu SOC) mais ne poussent pas dans les boites.
En ce qui concerne la concentration d'ampi je suis sure de moi.
Avant ma thése j'utilisais le même vecteur, avec des bactéries differentes (XL1-lue), le même protocole et ça fonctionnait du tonnerre....
Disons que je pencherais plutot pour une incompatibilité entre le vecteur topo et les bacteries JM-109 ...pour une raison qui m'est encore inconnue.

Merci pour vos réponses
Frikie

[A voir en vidéo sur Futura]