Sites de restrictions proches sur vecteur

[invite71f23525]

Bonjour,

Je dois cloner un cDNA dans un vecteur pET-15b (cf pièce jointe). J'ai choisi de faire un clonage orienté, ne pouvant pas utiliser NdeI qui clive mon cDNA, j'ai choisi XhoI et BamHI. Mais comme vous le voyez sur la carte du plasmide, ces deux sites sont accolés de telle façon que lorsque XhoI clive sa séquence (C/TCGAG), celle de BamHI (G/GATCC) se trouve à l'extrémité de l'ADN, avec même pas une base avant son site. Je voulais donc savoir si BamHI peut cliver son site de restriction lorsque celui ci se trouve trop à l'extrémité d'un fragment d'ADN? Je précise aussi que les 6 bases de la séquence palindromique de BamHI sont bien présentes après clivage par XhoI.

Merci d'avance.

Greg
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[invite17a570c1]

Salut,

J'ai un peu de mal à te suivre... Peut-être à cause de l'absence de la carte

[invite8c0cc995]

En général, les enzymes ont quand meme besoin de quelques bases apres.
Regarde ici, ca te donnera une idée du nombre de nt à avoir pour avoir une coupure à 100% (théorique) :
http://www.neb.com/nebecomm/tech_ref...zed_vector.asp

[invite71f23525]

Désolé j'ai oublié de joindre la carte du plasmide! La voilà dans ce message...

Merci IngDr pour ce lien super. J'étais allé sur le site de NEB mais visiblement je n'avais pas assez fouillé...Je vois que les deux enzymes que je veux utiliser clivent à 97% un fragment où une seule base est présente après le site de restriction...donc j'ose espérer que sans base, il y aura suffisamment de coupure. Ce qui me met en doute c'est qu'ils ne donnent aucun résultat sans aucune base après les sites. Si c'est du tout ou rien j'ai pas de chance. En plus je vois pas comment voir si ça a marché, pas avec un gel d'agarose c'est sûr car entre le fragment clivé une seule fois et celui clivé par les deux enzymes, il n'y aura que 5 bases d'écart.



Greg

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite17a570c1]

Salut

Tu ne peux pas choisir une autre enzyme, pour te faciliter la tâche?
Au pire, tu clones, puis tu fais une digestion de vérification avec une enzyme à site unique dans l'insert. Mais bon, si tu peux trouver un autre site, ce serait plus peinard

[invitec9f0f895]

Non a mon avis ca ne marchera pas !

Yoyo

[piwi]

Les enzymes de restrictions sont des endonucléases. Il faut donc nécessairement au moins une base avant le site de restriction. En principe c'est quand même bien d'avoir 5 ou 6 bases pour que l'enzyme puisse bien s'orienter sur le site de restriction. Cela dit le tableau de IngDr donne que la restriction est faisable dans tes conditions. Essaie!

Sinon, si ça ne fonctionne pas, tu peux ouvrir en NdeI BamHI (Tu vires ton XhoI du plasmide). Dans le même temps tu commandes des oligos complémentaires qui commencent par NdeI et BamHI et qui contiennent XhoI un peu à distance de BamHI. Tu digères NdeI BamHI et tu ligues.
Ensuite tu peux faire ton digest XhoI BamHI. Simplement attention à ta phase.

Vecteur
-----NdeI-----XhoI-BamHI----------

-----NdeI-----------BamHI---------

oligos
NdeI---XhoI---BamHI

construction
-----NdeI---XhoI---BamHI----------
le site XhoI est éloigné de BamHI, tu peux couper.
Encore une fois, attention à la phase!

Cordialement,
piwi

[invite71f23525]

Non à vrai dire je ne peux pas choisir d'autres enzymes. Un peu plus loin sur le vecteur, il y a un site Bpu1102I mais d'après les informations de son fournisseur, les extrémités cohésives générées sont peu favorables à la ligation et doivent être considéré comme des extrémités franches. Je peux toujours essayer avec cette enzyme qui n'est pas très populaire mais il y a des risques.

Sinon j'avais pensé à une solution un peu compliquée et probablement peu fiable. Digérer le vecteur avec ma première enzyme (XhoI). Liguer aux extrémités cohésives des linkers s'hybridant avec les extrémités cohésives puis faire une digestion avec la deuxième enzyme (BamHI) qui ainsi aurait un support convenable, et la première enzyme évidemment pour recréer l'extrémité voulue de l'autre côté. Un schéma aurait été le bienvenue...désolé.

Sinon, solution plus simple et probablement plus fiable : je change de vecteur mais je l'aime bien pET-15b et je suis pas le seul visiblement. Très intéressant mais dommage qu'il offre si peu de possibilités au niveau de la zone d'insertion.

Merci de vos réponses.

Greg

[invite71f23525]

Elle est pas mal du tout ta stratégie Piwi! Elle semble être faisable, et surtout les étapes sont simples. A méditer.

Merci

Greg

[invite17a570c1]

L'idée de Piwi est élégante, y a pas à dire

Au pire, j'ai déjà fait des clonages du genre : un même site de restriction (NdeI en plus...) en début d'insert et au milieu grosso-modo. L'autre enzyme était XhoI Je ne te copie pas, c'était il y a un moment et dans pET28.
Donc, j'avais 2 bouts d'insert : l'un étant 5'NdeI-----------NdeI, l'autre NdeI-------XhoI-3' . J'ai d'abord inséré le dernier, j'étais sûre d'avoir mon insert correctement ligué. Puis, j'ai inséré le dernier bout et j'ai envoyé à séquencer. Le tout avait réussi du 2e coup, alors que NdeI est une enzyme un peu space.

Bon courage!

P.S. Croisement, LXR

[gorben]

Salut,

Perso sauf si tu as besoin d'etre en phase avec quelque chose, je ferai une ligation blunt... carrement moins chiant. Il te suffit de commander 2 primers bien places pour le screen, et tu te prends pas la tete.

A+

[piwi]

Certes mais en général dans un pet du fais de l'expression. Donc tu dois être en phase avec le start du plasmide.

Cordialement,
piwi

[invite8c0cc995]

Tu fais une PCR pour avoir ton cDNA ?
Dans ce cas, ne fait pas un clonage orienté, utilise juste BamHI, et tu fais un screnning après pour vérifier l'orientation par digestion. Tu es sensé avoir 50% des clones positifs dans le bon sens.
L'argument de : "avec un clonage orienté, je n'ai pas de religation possible de mon vecteur sur lui même, et donc moins de bruit de fond. De même pas besoin de faire de déphosphorylation du vecteur", est juste théoriquement, mais dans la pratique, chacune de tes 2 enzymes ne coupant pas exactement à 100%, tu aurais toujours des vecteurs simplement digérés qui se religueront sur eux mêmes. D'où la nécessité de déphosphoryler pour diminuer le bruit de fond.

Piwi, technique élégante, petite question : le vecteur avec le MCS modifié, tu l'amplifie en bactérie avant de refaire la digestion par XhoI, ou bien tu enchaines les différentes étapes, car si tu amplifies en bactérie, comment fais tu pour discréminer un clone avec un MCS modifié d'un clone avec le MCS normal ? La différence de taille après digestion par d'autres enzymes ne me semblant pas vraiment jouable, je pencherai plus sur l'introduction d'un nouveau site de clivage non présent dans le vecteur, ce qui facilitera le screening pour trouver les clones modifiés.

[invite71f23525]

Bon finalement je vais tenter la stratégie de départ à savoir cliver par XhoI et BamHI sans aucune modification. En effet j'ai écrit au fournisseur du plasmide et il m'a aiguillé sur deux publies de qualité où les auteurs ont cloné des cDNA dans pET-15b en utilisant XhoI/BamHI :

Journal of Molecular Biology

Infection and Immunity

Les deux publies viennent de deux labos américains différents. Donc visiblement cette stratégie marche, je vais l'essayer et dans le cas où c'est un échec, je pense que je suivrais le conseil d'IngDr : cliver avec une seule enzyme de restriction puis screener.

Merci à Tous(tes)

Greg

[piwi]

Bien vu pour le nouveau site de clivage non présent dans le vecteur. C'est élégant là aussi.

Sinon on peut faire plusieurs choses:
Prendre un des oligos que l'on a introduit dans le vecteur pour faire du colonie lift (une sorte de southern blot in situ). Ca marche assez bien mais en général on le fait quand on a du mal à trouver des clones recombinants. C'est un peu l'artillerie lourde pour pas grand chose.

Le plus simple selon moi c'est bêtement de reprendre un des oligos que l'on a utilisé + un oligo de séquencage (T7 ou encore un oligo hisTag ou encore la thrombine dans le pet15b). Une petite PCR sur les clones et si ça amplifie c'est que l'oligo est dedans.

Cordialement,
piwi

[invite8c0cc995]

Le plus simple selon moi c'est bêtement de reprendre un des oligos que l'on a utilisé + un oligo de séquencage (T7 ou encore un oligo hisTag ou encore la thrombine dans le pet15b). Une petite PCR sur les clones et si ça amplifie c'est que l'oligo est dedans.

Trop simple effectivement, il n"y a plus de plaisir !

[invite71f23525]

Merci pour ces propositions de criblage. Sur ce point là j'ai déjà les étapes en tête, après transformation et culture sélective je ferais une PCR en premier pour cribler les clones positifs. Et après sélection des clones et amplification, je finirais bien entendu par un séquençage de tout l'insert ainsi que de quelques bases en amont et en aval. Je vous informerai du résultat de mon expérience!

Greg