Comprendre les cartes des plasmides

[invite0f6b6dee]

J'aurais une question concernant les cartes des plasmides en général:

je prends un exemple au hasard le plasmide pBR322 visible ici:

http://www.fermentas.com/techinfo/nu.../mappbr322.htm

Pourquoi certains gènes ont-ils une flèche dans un sens par ex. bla et rep et que tet est dans l'autre sens? La numérotation va dans le sens de tet. Donc en principe la lecture du brin se fait 5'-3' dans le sens de la numérotation non?

Mais si on veut insérer un bout d'ADN dans bla par exemple, il faut le placer dans le sens de bla? Ou c'est égal s'il est dans l'autre sens?
J'espère que ma question est claire...
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[invite6487dc7f]

Salut,
Je pense que je vais rien t'apprendre mais les gènes ont un sens de lecture pour être transcris, je suppose que les flèches indiquent le sens de lecture de chaque gènes.

Pour répondre à ta deuxième question je dirais: oui, après tout dépend de ce que tu insère et son but mais à mon avis le sens à son importance dans tous les cas.

A+

[invite160a5434]

Bien sur que le sens a une importance.

Il me semble que ce sens déterminer le sens de transcription du gène ... aussi, lorsque l'on insert un fragment, le sens aura une importance ( selon l'insert )/

[invite103b4423]

Le promoteur est situé sur l'extrémité 5' du gène, en amont de la séquence à transcrire. C'est pour cela que quand tu vas couper et ajouter l'adn qui t'interesse tu vas avoir un sens A et B. Le sens a choisir est celui ou on va avoir l'extremité 5' du gène. Si tu l'insères dans le mauvais sens de toute façon , tu n'obtiendras pas la protéine que tu cherches vu qu'on peut penser qu'un codon stop peut te couper la protéine et la masse moléculaire ne sera pas la même soit une protéine qui peut etre complètement inactive. En général , il faut reperer le sens 5' ou se situe le promoteur , on doit surement t'indiquer sur l'adn les bornes 5'>3' et 3'>5'.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite0f6b6dee]

Oui je vois. Comment vérifier que ton insert est dans le bon sens? Parce que si tu as une enzyme qui coupe des bouts non-francs, c'est ok, mais si l'enzyme coupe des bouts francs, l'insert peut se mettre dans n'importe quel sens.

Ce que j'ai du mal à comprendre c'est que il y a le brin 5'-3' et en dessous le brin complémetaire 3'-5'.

Par exemple la polymérase doit détecter le siet où elle doit se lier...elle lit le brin 5'-3' et aussi le brin dans l'autre sens alors?

ça fait comme si la polymérase lit dans le sens de tet mais aussi en même temps dans le sens de bla?

[invite103b4423]

Salut, avec de la chance dans ta séquence tu as des site de restriction ce qui fait que lorsque tu vas couper une enzyme de restriction en dehors de la séquence et une dedans même si c'est bout francs ou pas tu obtiendras donc un fragment d'une masse connu parce que tu as fais la cartographie de ton plasmide avec le sens A et B, puis par électrophorèse tu détermines lequel des plasmides possèdent le fragement en question avec le bon poid moléculaire. Tu peux également effectuer la transcription et placer un arn d'interférence qui est marquer avec un nucléotide radioactif et qui est sensé être la séquence complementaire de ton Arnm. Par autoradiographie , tu observes si il y a eu fixation des deux arn. Cela depend également de quel proteine tu veux obtenir , certaine ont des méthodes d'identification assez connu.

L'arn polymerase transcrit dans le sens 5'>3' toujour dans le brin 3'>5' mais cela va dependre du sens sinon pour la lecture des deux cotés c'est plutot un fragement de klenow qui est une adn polymerase I avec son activité endonucléasique en moins je crois. La si tu veux retaper des sites de restriction , c'est trés utile et tu as également la Taq polymerase qui est une adn polymerase qui te sert a effectuer des PCR avec des amorces dans les deux cotés de chaque brin.

[invite0f6b6dee]

Merci beaucoup pour toutes ces réponses!