Bonjour,
Je cherche à représenter un western blot sous forme d'histogramme.
J'ai vu que certains logiciel de retouche photo indique la "mean value" de gris de chaque bande mais je ne sais pas tellement a quoi cela correspond.
Je cherche une méthode pour déterminer les différences d'intensité entre les bandes et ceci en pourcentage (si c est bien la bonne facon de procéder...)
merci
regarde ici : http://www.lukemiller.org/journal/20...s-without.html
mais, perso je pense qu'il vaudrait mieux utiliser des "vrais" logiciel de quantification, avec identification des bandes, etc... L'oeil "humain" ne détecte pas suffisement de niveau de gris pour pouvoir détecter précisement le contour des bandes, au minimum imageJ, mais pas photoshop (sauf pour avoir juste une petite idée, mais pas une super quantif, notament en raison du bruit de fond qu'il faut gérer)
Il existe des appareils spécialisé (genre chemigenius), qui permette d'acquérir des images jusqu'à 65 000 niveaux de gris, couplé au logiciel genetool pour faire une analyse automatique (identification des pistes et des bandes, determination de la taille/poids moléculaire par rapport à une marqueur, détermination de la quantité par rapport à une gamme standard).
Quelques conseils généraux :
Sans appareil d'acquisition de fluorescence/luminescence (type chemigénius) par une caméra CCD refroidie, il faut scanner le blot. Cela peut être problématique, notamment si tu utilises un scanner à plat classique qui ne permet pas de scanner par transparence (c'est à dire qu'il y a un néon dans le couvercle qui se déplace).
Ensuite, il faut t'assurer que ton blot n'est pas saturé : tu ne peux pas comparer une bande surexposer avec une bande claire. C'est le gros soucis pour la quantification des blots, les expériementateurs "oubliant" que toutes les conditions ne sont pas quantitatives : le film a une gamme de réponse linéaire, le substrat aussi, la quantité d'anticorps joue aussi un rôle. C'est pour cela que l'idéal est d'avoir une gamme de quantité sur le même gel, et sur la même expo de la même protéine, pour t'assurer que tes conditions sont bien quantitatives. Bien sur cela est hyper exigeant. Donc on peut mettre au point ses conditions quantitatives en testant une gamme avec une certaines quantité d'anticorps, un certains temps d'expo, etc... L'expérimentateur devant alors utiliser ces mêmes conditions pour les manip avec les échantillons test.
Un moyen de palier ce problème de réponse linéaire limitée du substrat et du film est d'utiliser des anticorps primaire (ou secondaire) fluorescent, mais cela nécessite un dispositif d'acquisition particulier (comme cité plus haut).
Attention aussi, avec photoshop, il est possible, frauduleusement, de modifier spécifiquement l'intensité de certaines bandes. C'est pourquoi certains logiciels (comme genetools) ne permet de quantifier que des images non modifiées (format de fichier propriétaire). Il est alors possible de fournir la preuve aux reviewers (ou aux autorités) que les résultats ne sont pas truqués.
Cordialement,
ok merci beaucoup pour ces nombreux conseils qui m ont beaucoup aidé
"Ensuite, il faut t'assurer que ton blot n'est pas saturé : tu ne peux pas comparer une bande surexposer avec une bande claire. C'est le gros soucis pour la quantification des blots, les expériementateurs "oubliant" que toutes les conditions ne sont pas quantitatives : le film a une gamme de réponse linéaire, le substrat aussi, la quantité d'anticorps joue aussi un rôle." -> Je suis en effet tombé dans le panneau, certains de mes puits étant largement surchargés...
J'aurais tendance à penser que si vous cherchez vraiment à faire du quantitatif il faut alors se tourner vers une manip type ELISA.
Le western blot (semi)quantitatif on arrive à faire ça pour se se faire une idée mais dans le fond c'est quand même difficile de convaincre quelqu'un avec ça.
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
D'accord avec toi, mais pour faire un bon ELISA, faut avoir 2 anticorps spé sur protéine non dénaturée, de la protéine purifiée pour faire la gamme, etc...
L'ELISA a aussi ses limites, si ton epitope est masquée suite à une modif post traductionnelle ou au clivage de la protéine, ou si la structure locale au niveau de l'épitope est modifiée (suite à une modif post traductionnelle à distance, à la fixation d'un ligand, etc...) la protéine n'est pas détectée.
D'ailleurs, qu'en est il des protéines faisant partie de megacomplexe ? En SDS PAGE, tout est dénaturé, donc pas de problème, mais en ELISA, si le site est masqué ? Mes souvenirs d'ELISA remontent un peu, mais il ne me semble pas qu'on utilisait des conditions super stringentes ou je me trompe ?
Attention je n'ai pas dis que l'ELISA était super pratique et super simple à mettre en oeuvre. Je dis juste que si l'on veut vraiment quantifier des protéines c'est le moyen le plus convainquant. La quantification des bandes de WB c'est jamais terrible.
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
Bonjour
Personnellement, j'utilise un systéme nommé Odyssey, de chez li-cors.
C est comme un western blot normal, sauf que l'anticorps secondaire est un peu spécial. L'inconvenant, c est sue la révélation se fait grâce à un scanner spécial (scanner infrarouge) quidoit couter assez cher.
L'avantage,c est que tu peux utiliser 2 couleurs à la lecture, ce qui permet de faire 2 protéines de masse proches sur la même membrane.
J'ai été assez impressionné par ce systéme, qui permet des résultats tres reproductibles.
http://www.icmb.utexas.edu/core/DNA/...tern_07737.pdf
bonne soirée
capote
