Problème avec mes transformations

[invite0f6b6dee]

Bonjour!

Je réalise un travail en biologiem moléculaire et je suis actuellement à l'étape de la transformation qui ne fonctionne pas.

Voilà la situation:
j'ai un vecteur que je veux modifier. Je l'ai coupé pour récupérer la partie qui m'intéresse. J'ai ensuite créé un adaptateur (32 oligonucléotides) qui a une concentration de 10 uM.
J'ai réalisé la ligation entre cet adaptateur et le fragment isolé de mon vecteur (4032 pb). J'ai fait 2 ligations:
dans 20 ul au total:
ligation 1: 7.5 ul de l'adaptateur et 7.5 ul du vecteur
ligation 2: 10 ul d'adaptateur et 5 ul de vecteur

J'ai réalisé la transformation avec des cellules E.coli XL1-Blue MRF. Les cuvettes d'électroporation sont des 2mm. Les conditions d'électroporation étaient de 3 kV et normalement pour avoir un bon rendement, il faut que le pulse dure 5 millisecondes [ms].

J'ai utilisé 40 ul de cellules et 1 ul de ligation et ensuite 40 ul de cellules et 3 ul de ligation.
Le souci n°1 est que lors du pulse, avec 3 ul de la ligation 1, je n'ai plus que 2.10 ms au lieu des 5 ms. C'est encore pire avec la ligation 2, où là je n'ai plus que 1.20 ms.
J'ai donc fait en plus une électroporation en diluant 10x ma ligation 2. J'ai alors mis 40 ul de cellules et 1 ul de la ligation diluée 10x (là c'était correct 5.30 ms)

Le contrôle positif a été effectué en ajoutant du pUC18 aux cellules.

Le résultat des plaques: le contrôle positif a fonctionné, j'ai plein de colonies.
Le contrôle négatif, ok aussi, rien n'a poussé (toutes contiennent 100 ug/ml d'ampicilline).

Par contre il n'y a rien sur les autres plaques. J'ai étalé 100 ul pour chaque solution de transformation et le reste j'ai centrifugé et étalé le concentré sur une autre plaque.

La seule plaque où il y a une colonie est celle de la ligation 1 avec 3 ul (version concentrée).
J'ai pris un peu de la colonie et je l'ai étalée sur une nouvelle plaque. Je verrai demain si ça poussé et si jamais je mettrai en culture.

Mais cette transformation me pose un grand souci tout de même. ça ne fonctionne pas avec mon produit de ligation.

Est-ce que vous auriez des propositions à me présenter pour améliorer cette transformation? J'espère que c'est assez clair. C'est toujours difficile d'expliquer la situation par écrit.

Merci!
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[invitec9f0f895]

salut

essaye de prendre des XL1 supercontentes chimique, que tu transformera par choc thermique. Ca t'évitera les soucis d'électroporation.

Yoyo

[invite0f6b6dee]

Merci pour la répomse Yoyo.
J'ai un protocole pour la transformation pour rendre les cellules compétentes par chlorure de calcium puis effectuer le choc thermique.

Dans ce protocole on utilise 200 ul de cellules compétentes + 20 ul du produit de la ligation et comme autre transformation avec 60 ul du produit de la ligation.
Si je fais d'après ce protocole, il faudra que je refasse plus de produit de ligation. Mais je n'aurai plus assez de mon vecteur. Il faudra que je fasse à nouveau la restriction puis l'isolation du fragment.

Si vous avez l'habitude de faire des transformations par choc thermique, quelle volume du produit de ligation mettez-vous en général pour que ça fonctionne bien?

[invite0f6b6dee]

HELP!

[A voir en vidéo sur Futura]

[piwi]

ligation 1: 7.5 ul de l'adaptateur et 7.5 ul du vecteur
ligation 2: 10 ul d'adaptateur et 5 ul de vecteur

Vous devez avoir des quantités equimolaires de produits de ligation (vecteur et adaptateur). Vous avez probablement un très fort excedant en adaptateur. Il est possible que vos ligations ne fonctionnent pas. D'ailleurs, en général il est bon de le faire dans le plus petit volume possible, 10µl

[invite0f6b6dee]

Merci piwi!
C'est ce que je vais faire. Il faut que je quantifie exactement quelle concentration j'ai de mon vecteur. Ensuite j'essaierai d'avoir une quantité équimolaire des deux. J'ai réalisé la ligation dans 20 ul au total, car j'utilise une partie de la ligation pour mettre sur gel comme contrôle. Il est possible parfois de voir si la ligation a fonctionné avec le gel (des fois on ne voit rien et des fois oui).

[invite0f6b6dee]

Re-bonjour!

Si qqn peut me conseiller encore et toujours sur mes ligations.

J'ai mesuré la concentration de mon fragment de vecteur: 2.15 ng/ul (je l'ai trop dilué alors maintenant la conc est assez basse).
Etant donné que le poids moléculaire du fragement est de 2.68*10^6g/mol, j'ai 8*10^-16 mol/ul.

Maintenant pour l'adaptateur. Le poids moléculaire est de 1.996*10^4 g/mol. J'en ai 1*10^-11 mol/ul (connu). Cela veut dire que la concentration est de 196 ng/ul.

Le souci maintenant c'est pour faire une ligation qui contient des quantités équimolaires d'insert et de vecteur 1:1.

J'ai lu qu'il fallait entre 1-10 ng/ul dans la ligation pour qu'il y ait de bons résultats. Est-ce vrai?

Le problème est que mon adaptateur est trop concentré. Je devrais le diluer 12'500 x pour qu'il soit à la même molarité/ul que mon fragment. Et si je le dilue, je n'aurais plus que 0.015 ng/ul de concentration. Alors pour atteindre au moins 1 ng pour la ligation, je devrais en mettre 100 ul. ça ne va évidemment pas.

Ce que j'ai présenté ci-dessus, c'est si je ne mets qu'1 ul de mon fragment. Imaginon que j'en mette 5 ul (ça me fera une concentration de 10.75 ng). Le nombre de mol sera de 4*10^-15. Là encore mon adaptateur est trop concentré et je devrais le diluer et on retombe dans le même problème qu'avant.

Est-ce quelqu'un peut m'aider à résoudre le problème? Je ne sais pas trop comment faire...J'espère qu'avec tous ces chiffres, c'est tout de même compréhensible!

Merci d'avance!