Internalisation et trypsine

[inviteeb6b9cf7]

Bonjour à tous ! J'espère que vous allez bien !

Je travaille sur une expérience d'endocytose ! voici le lien, il s'agit de l'exercice 2 question 3 (là ou il ya les graphes de cytométrie en flux):

biologie.univ-mrs.fr/upload/p219/TD2_endocytose_2004.pdf

J'aimerais avoir votre avis sur cette question 3 (les questions sont indépendantes, pas besoin d'avoir vraiment répondu à la question 1 et 2).
Voilà ce que j'en pense :

une cellule est positive quand elle a internalisé une molécule fluorescente, donc il y a eu endocytose! et parmi les cellules qui ont endocyté, on regarde la quantité de molécules florescentes internalisées.

- courbe noire : témoin négatif. On a le nombre de cellules positives sur lesquelles on travaille. positif car mm si il ya pas de peptide fluorescent, il y au seuil de fluorescence minimum.
valeur à 37°C : 240 cellules positives et niveau de fluo 5
valeur à 4°C : idem (attention les échelles ne sont pas la mêmes)

- courbe rouge :
valeurs à 37 : 130 cellules et niveau 90
valeurs à 4 : 210 celles et niveau 10

- courbe bleue : témoin positif, pas de traitement
valeurs à 37 : 130 cellules et niveau 110
valeurs à 4 : 150 cellules et niveau 90
pourqyoi a-t-on si peu de cellules positives par rapport au témoin négatif ?


- traitement à la trypsine :
je sais que la trypsine est un enzyme protéolytique qui clive derrière les acides aminés basiques donc elle coupe les protéines. or on a besoin pour l'endocytose (phagocytose) de récepteurs sur le macrophage pour attraper les molécules à internaliser !
on voit que quand on rajoute de la trypsine,
a 37 :il y a le mm nombre de cellules positives mais la quantité internalisé est passé de 110 à 90
a 4 : il y a augmentation de cellules positives mais la quantité diminuent aussi de 90 à 10

comment interpréter ca ?

-l'effet de la température
je sais qu'a 4°, on inhibe l'endocytose ! on l fait quand on veut suivre une cinétique, pour ralentir l'endocytose car sinon la florescence est digérée et rien n'est visible en fluorescence.

on voit quand on passe de 37 à 4°C :
courbe rouge et bleue : il ya plus de cellules actifs , mais diminution de la quantité


- quelles conclusions :
la trypsine fait diminuer dans les deux cas la quantité internalisé, donc l'endocytose est moins efficace. la trypsine coup les protéines d'attaches, alors pourquoi on voit quand mm de la fluo ? pquoi il ya qd mm eu de l'endocytose (phagocytose)? est ce qu'il y avait deja eu internalisation ?
quand a la température ? a 4°c peut etre que la cellule attrape la mocélule fluo mais il ya pas internalisation alors qua 37, elle attache et internalise ?


Qu'en pensez-vous ? ai-je dit des bétises ou oublié des choses ?

merci pour votre aide !
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[inviteeb6b9cf7]

j'ai peut-etre un peu trop écrit !

[piwi]

Peut être que personne n'a eu encore envie de rédiger une réponse.
Ne vous inquiétez pas et soyez patient.

Cordialement,
piwi

[inviteeb6b9cf7]

bonjour,

ya qqch de bizarre maintenant que je j'y pense :
d'ou vient le seuil minimum de fluorescence quand on incube les cellules sans peptide fluo ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitec25c96a0]

Bonjour,

Avec les cellules seules (sans peptides), on mesure leur autofluorescence (fluorescence naturelle). ça permet de régler le négatif. Tous les événements (cellules) qui ont une fluorescence supérieure au négatif sont considérés comme positifs (présence du peptide).
Un autre point, votre raisonnement sur le nombre de cellules est faux. Avec les seuls histogrammes vous ne pouvez pas savoir quel nombre de cellules ont été analysées. Par contre on peut dire que 100% des cellules sont positives quelque soit la condition.


bon courage

[inviteeb6b9cf7]

Bonsoir,

merci sansplomb d'avoir répondu !

j'ai compris pour la fluorescence. Mais pour le nombre de cellules, je peux pas dire que le nombre de cellules est 240 ? car il se peut qu'il y ait des cellules sans aucune fluorescence et qu'on ne voit pas sur les graphiques ? comment doit-on alors lire l'odonnée du diagramme ?

savez vous pourquoi il ya internalisation de fluorescence en présence de trypsine ? si la trypsine coupe tous les recepteurs, on devrait plus avoir d'endocytose, a moins que quelques recepteurs ne soient pas touchés ?

Pour la température, pouquoi l'endocytose est moins efficace à 4°? je sais que c'est pas une tempéraure physiologique pour les macrophages, mais techniquement qu'est ce qui se passe sur le plan moléculaire ?les recepteurs changent de conformation et n'attrapent plus ?

et c'est bizarre de voir qu'a 4°, il ya effectivement moins de cellules fluo internalisés, mais plus de macrophages qui endocytent qu'a 37°C ? comment interpreter ca ? peut etre que cette difference nest pas significative

merci

[invitec25c96a0]

Bonjour,

j'ai compris pour la fluorescence. Mais pour le nombre de cellules, je peux pas dire que le nombre de cellules est 240 ? car il se peut qu'il y ait des cellules sans aucune fluorescence et qu'on ne voit pas sur les graphiques ? comment doit-on alors lire l'odonnée du diagramme ?

les 240 cellules correspondent à une valeur unique d'intensité de fluorescence égale à 5. mais la courbe (une presque Gaussienne) est construite avec plusieurs intensités qui sont de part et d'autre de la valeur 5 (le maximum). Pour chaque intensité il existe X cellules qui prennent cette valeur.
A moins de dessiner toutes les valeurs possible d'intensité et de déterminer le nombre de cellules en Y vous ne pouvez pas connaitre le nombre exact de cellules.
Mais dans votre cas, ça na pas d'importance de connaitre ce chiffre
(puisque 100% des cellules sont marquées). Le seul point intéressant est la variation de l'intensité du marquage (la quantité de peptide fluo attaché à la cellule).
D'une façon générale on prend rarement en compte le chiffre en ordonnée puisque l'on dispose des statistiques associées à chaque pic ou courbe.

bon courage

[inviteeb6b9cf7]

bonsoir,
merci sansplomb pour ces explications

que pensez vous du reste de mon raisonnement par rapport a la trypsine et temperature ?