Co-Immunoprécipitation

[invite9ac1cde7]

salut salut

petit problème avec la Co-Immunoprécipitation (d'ailleurs, y a pas beaucoup de sites qui parlent de cette technique.. c'est bizarre.. c'est parce-qu'elle est mal connue ? ou alors peut être qu'il y a des techniques plus efficace..)

bref

dans mon cours on me dit :

on part d'une cellule, on solubilise les membranes donc on obtient un lysat cellulaire.

on fait incuber ce lysat avec un Anticorps de la protéine à étudier (Anticorps modifié : on y accroche un sucre pour que le tout soit plus lourd) ce qui fait qu'on récupère un complexe.

on fait une électrophorèse en conditions dénaturantes (et là j'ai écrit excès d'anticorps je sais pas pourquoi. C'est quoi des conditions dénaturantes pour un complexe protéines-anticorps ??)

bref en gros ça revient à faire un Western Blot non ??

mais par contre je comprends pas comment on analyse le résultat de l'électrophorèse ?


voilà.. j'crois qu'j'ai tout dit.
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[gorben]

Salut,

C'est pas faux mais c'est incomplet.
Le but de la methode est de recuperer quelque chose qui va etre associe a ta proteine (ligand, proteine, ADN etc...) le plus courant etant une autre proteine.
En fait il te faut 2 choses :
1) un moyen de purifier ta proteine connue (et en meme temps tout ce qui est fixe dessus)
2) un moyen de detection qui te permette de specifiquement detecter ce qui serait fixe a ta proteine

Pour la partie 1) soit tu possedes un Ac specifique de ta proteine, dans ce cas tu fais une immunoprecipitation, ie que ton Ac va reconnaitre ta proteine, et que tu vas ensuite purifier ton Ac par diverse methode (je ne connais pas la methode du sucre) generalement tu utilises des billes (agarose/magnetique) couplees a des proteines A/G qui vont fixer les Ac. Tu rajoutes donc tes billes, elles vont fixer les Ac qui seront eux meme fixes a tes proteines, qui seront elles memes fixees a des "inconnus". Comme les billes sont lourdes (ou magnetique) il est facile de les recuperer par centrifugation (ou par un aimant).
Une fois que tout est purifie, il faut passer a l'etape 2) pour detecter ce qui est fixe.

Evidemment tu auras ta proteine connue (tu t'en ai servipour la precipitation) mais tu auras aussi des inconnus qui va te falloir reveler par differentes methodes (electrophorese/ MS etc etc etc)

Voila, sinon c'est une methode plutot commune, et je suis surpris que tu n'ais rien trouve sur google. Tu peux essayer avec les mots clefs Co-IP ou meme ChIP (pas tout a fait de la co-IP, maisle principe est le meme)

A+

PS : des conditions denaturantes c'est un vulgaire SDS-PAGE

[invite8c0cc995]

Le but de la co-immunoprécipitation est de vérifier une interaction entre une protéine A et une protéine B.
1. Tu incubes ton anticorps avec ton lysat (ou se trouve le complexe A-B). Ton anticorps se fixe sur ta protéine d'intéret A
2. Tu rajoutes des billes de sepharose ou d'agarose sur lesquelles sont greffées de la protéine A ou G, qui ont la particularité de fixer les anticorps. Ton complexe Antigene Anticorps est donc capté par les billes. tu as donc :
Billes ==> Anticorps ==> complexe A + B
3. Tu centrifuges, les billes (avec les anticorps, donc tes protéines d'intéret), sédimentent au fond de ton tube.
4. Tu enlèves le lysat au dessus des billes, tu laves tes billes pour enlever les protéines fixées aspécifiquement.
5. Tu rajoutes un tampon dénaturant (SDS et b-mercaptoethanol), qui va dissocier et dénaturer les anticorps, libérant ainsi les protéines A et B.
6. Tu déposes sur gel et fait un Western Blot. Tu révèles avec un anticorps dirigé contre ta protéine B (alors que l'IP a été faite avec un anticorps contre la protéine A). Si tu as une bande au poids attendu pour B, cela signifie que tu as co immunoprécipité B avec A. donc que B interagit avec A. Pour controler, tu reincubera la membrane avec un anticorps anti A pour vérifier la présence de la protéine A (sinon cela signifie que ton IP n'a pas marché, donc il est normal que tu ne vois pas B).
Tu peux faire la manip dans l'autre sens, Immunoprécipité avec un anticorps anti B, et vérifier la présence de A.
Tu peux aussi immunoprécipiter avec un anticorps anti C (autre protéine connu pour ne pas interagir avec A ni B), et vérifier la présence de A ou B. Si tu détectes A ou B, cela signifie que tu as une fixation aspecifique de ta protéine sur les billes, que tes lavages n'étaient pas bons. Bref, les résultats ne sont pas interprétables.

Edit : zut, j'ai pas été assez rapide !!!!

[noory]

merci pour ce topo super clair !

[A voir en vidéo sur Futura]