Bonjour,
je vais réaliser une ChIp et j'aurai voulu savoir si au moment du decrosslink il était possible de répurer des protéines pas trop amochées afin de pouvoir les identifier ou bien ces deux approches sont elles totalement incompatibles?
merci
Salut,
Je suis en plein dans du ChIP, je ne sais pas comment tu crosslink, ni comment tu unlink, mais perso je crosslink au formaldehyde puis unlink par chauffage 2h 42 degres et 6h 60 degres en rajoutant de la pronase.
Du coup mes proteines sont absolument toutes degradees par la pronase et ne peuvent pas servir. Peut etre qu'en eliminant la pronase ca pourrait marcher, a condition que ton identification ne requiere pas une structure native de la proteine.
A+
pareil pour le crosslink
pour le unlik c'est censé etre pareil mais j'aurais justement voulu savoir si le seul chauffage détruisait "spécifiquement" les liaisons créées par le formaldéhyde et donc si je pouvais espérer récupérer les protéines
l'identification se ferait par spectro de masse donc pas de pb de structure et le formaldéhyde ne devrait pas trop bousiller les protéines vu que l'anticorps peut les reconnaitre. le probleme serait donc au niveau du decrosslink et peut etre de la quantité de prot. je ne sais pas à quelle quantité s'attendre ni quelle quantité est nécessaire pour de la protéomique. Apparement ce n'est pas une pratique courante donc je suppose que ca ne doit pas marcher. mais si quelqu'un en sait plus ca serait sympa
merci en tout cas
Sans pronase, tu peux essayer, mais pour ma part je n'ai jamais reussi dans des conditions "douces" (cf ci dessus) a avoir un unlink correct. Qd je ne met pas de pronase, en general je fais bouillir mes echantillons 30min pour le unlink et la, tout est separe. Les proteines sont par contre bien abimees, mais je ne pense pas que ca empeche la SM.
La derniere fois que j'ai fais de la SM, la quantite minimale de proteine etait : "ce qui est visible par coomassie". Tu dois pouvoir trouver assez facilement le seuil de detection sur internet je pense.
A+
merci!
je vais voir ce que je peux faire alors...
