Dissolution d'un culot de protéines

[invite10adf645]

Bonjour,
aujourd'hui j'ai tenté de précipiter des protéines à l'acétone.
Ca a formidablement bien marché, si bien que je n'arrive pas à resuspendre mes culots. J'ai essayé la pipette et le vortex mais mes culots continuent de danser dans leurs tubes en blocs blancs solides.
Vous avez une astuce pour les culots récalcitrants ? Chauffer (j'ai peur d'abimer mes protéines qui doivent passer en western blot derrière) ?
Pour info je cherche à les reprendre dans un tampon tris saturé en urée & thiourée + 4% CHAPS

Merci !
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[invite8c0cc995]

J'avais aussi eu ce genre de soucis apres précipitation à l'acétone.
Deja une premiere astuce : ne pas congeler le culot sec, j'ai trouvé que la dissolution est beaucoup plus difficile après.
Sinon moi je le reprenais dans mon tampon de dépot (SDS et b-mercapto) pour Western, et je faisais bouillir immédiatement pendant 10min, puis je déposais.

[invite10adf645]

Le souci c'est qu'il faudrait que je dose mes prots avant de les reprendre dans du Laemmli (donc avec SDS et beta-ME).

J'ai vu que certains font une incubation overnight à 4°C pour faciliter la dissolution. Du coup j'ai mis mes tubes au frigo et on verra si c'est plus facile demain !

[invite10adf645]

J'en suis venu à bout à force de vortex et de pipetage.
J'ai aussi doublé le volume de tampon et ça a pas mal facilité les choses.

Maintenant je suis confronté à un autre problème : mon kit de dosage réagit avec mon tampon (urée ?).
Quelqu'un a une idée ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite85934679]

Salut, j'ai été aussi dans ton cas...

Pour doser les protéines extraites dans un tampon avec du SDS, je dose avec le kit BCA de Pierce. Pour les protéines dans de l'urée (8 ou 9M) je dose avec le Bradford. Il y a peut-être quelqu'un dans un labo près du tien qui en a un peu ?

[invite10adf645]

Merci fxmulder !
Le problème que j'ai eu c'est avec un kit BCA. J'ai appelé le commercial qui m'a dit que ça venait de l'urée et que les kits des concurrents (par exemple basés sur la méthode de Bradford) ne feront pas mieux. Par contre il m'a envoyé la référence d'un kit qu'ils font pour purifier mes échantillons.
Uptima (pour ne pas les nommer) ne cherche vraiment qu'à faire du buisness !

Je vais essayer le bradford si j'en trouve !

Sinon Amersham (je cite des marques mais c'est ptet interdit ?) fait un kit de quantification destiné spécialement à tous ceux qui font les bourrins avec les chaotropes, les détergents etc... Si ça intéresse du monde dans mon labo (kit 500 assays quand meme) je le testerai.

Merci encore !