Besoin explication température d'hybridation

[invite56ef7b5a]

bonjour,

je réalise une PCR qui utilise 3 amorces dont les Tm sont 70 °C, 68°C, et 66°C

pourtant la température d'hybridation utilisée dans le thermocycleur varie de 59 à 45 °C (intervalle de 1 °C a chaque cycle), alors que j'aurais pensé qu'il fallais une Ta de 63°C.
si quelqu'un pouvais explique assez simplement pourquoi cette différence je lui en serait très reconnaissant
merci
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[invite10adf645]

Le Tm (melting T°) est la température pour laquelle 50% des primers sont hybridés.
En PCR on cherche à ce que le maximum d'amorces soient hybridées (dans l'idéal 100%). Alors on se place générallement 5°C (voir plus) en dessous du Tm (c'est la température d'annealing ou Ta).
Le tout est d'être suffisament haut pour être spécifique de la séquence à amplifier, et suffisament bas pour hybrider correctement les amorces. Souvent on le détermine expérimentalement en faisant un gradient de Ta sur le cycleur (on teste plusieurs Ta différents quoi).