Je ne comprends pas pourquoi on se place 5°c en dessous du Tm pour la température d'hybridation de la PCR.
J'ai déterminer un Tm de 52°c avec les amorces mais dans l'article ils utilisent une température d'hybridation de 54° ; est-ce parce que en dessous de 54° l'hybridation n'est plus assez spécifique ?
Tm = 81.5 + 16.6 log M + 41(XG+XC) - 500/L
J'ai trouvé pour les 54°c, apparement certains utilisent 500, d'autres 600, d'autres 675 dans cette formule... mais pourquoi ??
En effet, quand on approche des 50deg, on augmente les risques d'amplification non specifique. Mais ca peut quand meme marcher a 52 deg, ca depend aussi de la matriceEnvoyé par ggpessoa
A mon avis, dans le doute, le mieux est de faire un petit essai avec differentes temperature et de choisr la plus elevee qui donne une belle bande. c'est simple, rapide et efficace
Noun
Tu peux aussi jouer sur le tampon, la concentration en MgCl2 est très critique... dans mon labo on produit nous-même la Taq, et avec un même couple de primer à température constante on a dû tester qq tampons: c'est TRES important
je connais pas ta formule pour determiner le tm d'une amorce mais tellements de parametre rentrent en jeux dans l'hybridation d'un oligo pendant ta PCR qu'en general pour etre sur de son coup on enleve 5° à la temperature que l'on a calculé.
Sans rentré dans des cas spécifiques, je vais repondre simplement à ta simple question :
--> Pourquoi enlever 5°C au Tm pour l'hybridation ?
La réponse est simple, il suffit de savoir ce qu'est ... theoriquement ... le Tm. Le Tm est la température à laquelle statistiquement, il n'y a que la moitié des liaisons des appariements qui sont formés. Et la moitié, c'est bien insuffisant pour un hybridation d'amorce....
J'espère avoir été clair.
Justement c'est ce que je ne comprends pas. Dans ce cas on devrait prendre une température supérieure au Tm pour être sur que l'on a plus de 50% d'ADN sous forme monobrin. Si on prend une température inférieure au tm, ça veut dire qu'on aura plus d'ADN sous forme double brin que sous forme simple brin. alors pourquoi Tm-5 ?La réponse est simple, il suffit de savoir ce qu'est ... theoriquement ... le Tm. Le Tm est la température à laquelle statistiquement, il n'y a que la moitié des liaisons des appariements qui sont formés. Et la moitié, c'est bien insuffisant pour un hybridation d'amorce....
Tu ne confond pas temperature d'annealing et température de dénaturation ?
l'annealing sert a hybrider les amorces a la matrice, donc il faut etre en dessous pour permettre ces hybridations.
YOyo
Hello !
Je pense que Yoyo a vu juste, ne pas confondre ces deux valeurs...
Oui mais il faut bien que l'ADN soit suffisamment dénaturer sinon l'hybridation n'est pas possible sur de l'ADN bicaténaire. Et c'est bien pour cela qu'on prend comme référence le Tm qui en fait est une température de demi-dénaturation.
Maintenant pourquoi on se place 5°c en dessous du Tm pour avoir la température d'hybridation ? J'y pense maintenant ça doit être un compromis entre une dénaturation suffisante de l'ADN (ou plutôt une renaturation pas trop rapide de l'ADN après l'étape de dénaturation pour permettre l'hybridation aux amorces) et une température suffisamment basse pour permettre l'hybridation (d'où 5° en dessous du Tm). Non ?
La denaturation s'effectue a 94°C pour séparer les deux brins d'ADN. Les amorces etant en large exces par rapport a la matrice lors de l'hybridation (a un Tm bas pour etre certains qu'elles s'apparieront) leur hybridation avec la matrice est favorisée.
Yoyo
bonjour,
j'ai une question concernant la pcr:
on est en presence de la molecule double brin suivante:
GGCTACACAGCCTCTTT
CCGATGTGTCGGAGAAA
on demande d'effectuer sur cette molecule une pcr avec les oligonucleotides GGGCTACA et TTTGAGGC et donc de trouver la taille de la molecule obtenue...
En fait ma question est la suivante: pour faire une pcr est il necessaire que les amorces soient hybridés sur toute leur longueur?
merci
non,pour faire une pcr est il necessaire que les amorces soient hybridés sur toute leur longueur?
pour obtenir une amplification il suffit que l'extrémité 3' de chaque amorce soit bien hybridée : c'est comme ça qu'on obtient des amplifications non spécifiques ou qu'on ajoute des sites de restrictions à une séquence d'ADN.
En cas de compétition entre 2 sites d'accrochage d'une amorce, c'est le produit le plus court qui est plus facilement amplifié même si l'hybridation de l'amorce sur la séquence est imparfaite.
Annaïck.
