Bonjour,
J'ai une autre petite question, j'ai compris comment fonctionnait une PCR mais pendant notre TP on a fait une étape à 95°C pendant 10min avant de commencer les cycles de la PCR. Normalement à 95°C c'est pour dénaturer les 2 brins d'ADN mais pendant le cycle 15secondes suffisent alors pourquoi on fait 10min avant?
Merci d'avance
Marjorie
bonjour,
Avant de commencer ta PCR, ton ADN est souvent en "pelote". cette étape de chauffage va servir à bien dénaturer tous tes doubles brins. Elle dure 10 minutes pour etre sûr que tous tes brins vont se séparer.L'amplification va ensuite pouvoir commencer sans problème...
C'est pour activer la polymérase. Afin d'éviter l'amplification de produits aspécifiques pendant la préparation de la PCR, les dernières générations de Taq doivent être activée à la chaleur (Hot Start en anglais). Il se peut aussi que ta Taq ait été incubée avec des anticorps bloquant son activité. Le fait de chauffer 10min libère la polymérase.
Ceci est valable pour l'ADN génomique. Pour un plasmide, 2 min suffisent largement. Pour l'ADN génomique, je préfère chauffer une fois pour toute à 95° pendant 10min, puis mettre sur glace (important pour que les 2 brins ne se ré apparient pas totalement).Envoyé par ccharly84
